高温下抗性和敏感小菜蛾细胞凋亡及Px-caspase-1b克隆与表达

论文摘要

Caspases基因是细胞凋亡过程中的重要基因,它的过度表达会引起生物发生细胞凋亡,进而诱导生物机体的死亡。本研究以小菜蛾为研究对象,研究其细胞凋亡,不仅具有重要的经济价值,而且具有重要的生物学意义。本实验以小菜蛾为研究对象,在25℃,35℃和40℃下分别处理24h、48h、72h,利用彗星电泳实验,检测小菜蛾卵细胞凋亡现象；细胞凋亡的发生是与caspase基因的表达密切相关的,于是通过设计一对兼并引物,RACE及巢式PCR克隆得到了小菜蛾的一个基因全长序列,经过比对属于caspase基因家族,命名为小菜蛾Px-caspase-1b;最后利用荧光定量PCR研究小菜蛾Px-caspase-1bmRNA的表达量与温度和时间之间的相互关系,实验中选取了最具有代表性的温度33.5℃和40℃,处理时间分别为3d和9h,对照组采用的是常温25℃,内参基因选用的是β-actin。通过彗星电泳实验,发现随着处理温度的升高和时间的延长,抗性和敏感小菜蛾的细胞凋亡水平都逐渐升高,以40℃、72h的细胞凋亡水平为最高,但抗性小菜蛾的细胞凋亡远高于敏感小菜蛾的。实验中利用兼并引物首先克隆得到一段长度为645bp的中间序列的片段,经比对它属于caspase基因家族,然后利用RACE技术,分别在3’和5’端设计一对特异性引物,克隆得到长度分别为1119bp和637bp的两段片段,根据三段序列间的重叠区,最后拼接得到一段长为2284bp的基因全长序列。最后根据得到的序列,在序列的两端设计一对特异性引物,经PCR后得到一段长为990bp的基因序列,其中包含一个完整的开放阅读框。经比对,这个基因属于昆虫的caspase-1基因家族,命名为小菜蛾Px-casapse-1b。荧光定量PCR实验结果表明,抗性小菜蛾Px-casapse-1b mRNA表达量,随着温度和时间的升高而大幅度增加,敏感小菜蛾Px-casapse-1b mRNA表达量在33.5℃虽有所增加,但幅度不大,40℃时没有增加。研究结果表明,高温诱导可以使小菜蛾细胞凋亡,且高温下敏感小菜蛾的细胞凋亡水平远低于抗性小菜蛾,这从分子生物学的角度说明了敏感小菜蛾更耐高温的生理特性,对于基础生物学的研究具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 细胞凋亡概念
• 2 哺乳动物caspase家族成员的种类及分类
• 3 昆虫caspase研究概况
• 4 高温与昆虫细胞凋亡的关系
• 5 研究背景、内容及目的意义
• 第二章 小菜蛾卵细胞的细胞凋亡检测
• 1 实验材料与方法
• 1.1 试验材料与主要仪器和试剂
• 1.2 主要试剂的配置
• 1.3 实验方法
• 2 细胞DNA损伤的评价指标
• 3 实验的结果与分析
• 3.1 实验结果
• 3.2 实验结果分析
• 第三章 小菜蛾Px-caspase-1b基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂与主要仪器设备
• 1.3 药品配制
• 2 Px-caspase-1b基因中间片段克隆
• 2.1 设计引物
• 2.2 提取总RNA
• 2.3 反转录成cDNA
• 2.4 PCR
• 2.5 跑胶及图片观查
• 2.6 PCR产物纯化（试剂盒方法）
• 2.7 TA克隆
• 3 Px-caspase-1b基因两端序列的克隆：即：巢式PCR
• 3.1 引物设计
• 3.2 cDNA第一链合成
• 3.3 巢式PCR
• 4 Px-caspase-1b基因ORF的扩增
• 5 小菜蛾Px-Caspase-1b克隆与序列分析
• 5.1 Px-Caspase-1b中间片段的的分析
• 5.2 Px-Caspase-1b基因5’和3’端的基因克隆及序列分析
• 5.3 Px-caspase-lb 的克隆
• 5.4 Px-Caspase-lb基因序列分析
• 第四章 高温处理后小菜蛾Px-Caspase-1b基因mRNA表达量差异的测定
• 1 荧光定量PCR的原理及优点
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 高温处理后小菜蛾Px-Caspase-1b基因表达量的分析
• 3.1 内参基因与目的基因标准曲线的制作
• 3.2 不同温度处理的小菜蛾Px-caspase-1b mRNA表达量差异
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢