色胺酮对人白血病细胞株K562的体内外抑制作用及其机制研究

论文摘要

1研究目的色胺酮（Tryptanthrin,TRYP）,为吲哚喹唑啉类生物碱,化学名称为吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮。黄色针晶,熔点267-268°C。最初由马蓝（Strobilanthes cusia）、蓼蓝（Polygonum tinctorium Lour）、菘蓝（Isatis tinctoria L.）等产蓝植物中得到。文献报道TRYP具有抗细菌真菌、抗炎、抗肿瘤及抗寄生虫等多种药理活性。但由于TRYP的来源有限,目前国外多集中在TRYP的分离、提取及合成,药理活性研究多集中在抗炎及少量抗肿瘤等方面。TRYP对血液系统肿瘤的作用也仅局限于对急性早幼粒白血病细胞的影响,但TRYP对慢性髓系白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期等作用的研究尚未见报道。本课题以仿生合成得到的TRYP为研究试药,采用体外培养肿瘤细胞和建立体内动物模型等方法,探讨和揭示TRYP对人白血病细胞K562的体内外抑制作用及其机制研究,为TRYP的新药开发提供实验依据。2方法2.1 TRYP对8株人源性肿瘤细胞的MTT及抑制K562细胞增殖和诱导凋亡的研究:以A549、HepG2、SW480、Eca-109、GRC-1、LNCAP、A375、K562等8株人源性肿瘤细胞为靶细胞,以抑制增殖为指标,筛选TRYP对肿瘤细胞株的敏感性,然后以最敏感的肿瘤细胞为研究对象;同时,确定TRYP对该敏感细胞体外作用的药物浓度及作用时间;然后取对数生长期的细胞,分别以不同浓度TRYP作用一定时间后,收集细胞,分别采用相差显微镜、Hoechst 33258荧光染色法、透射电镜等方法观察细胞的形态学改变,Annexin-V- FITC和PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率;PI单染色检测细胞周期的变化。2.2 TRYP对K562细胞作用机制研究:Rhdamine123荧光染色进行线粒体跨膜电位测定;利用SYBR Green RT-PCR方法检测TRYP作用K562细胞后凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA、融合基因bcr/abl mRNA的表达变化;Western blot法检测K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-c、caspase-3及融合蛋白bcr/abl的表达。2.3 TRYP对小鼠K562白血病的作用及其机制研究:在体外抗肿瘤实验研究的基础上,以荷瘤小鼠为动物模型,观察TRYP对小鼠K562白血病的作用。采用CTX预处理,8×106个K562细胞/鼠尾静脉接种SCID小鼠建立白血病动物模型;50mg/kg、25mg/kgTRYP灌胃14d,观察动物的体质量,外周血白细胞数及其分类和骨髓涂片、bcr/abl mRNA表达、细胞周期变化、细胞表面抗原CD13检测,并取骨髓、心、肝、脾、肺、肾等重要脏器进行病理切片HE染色等,综合评价TRYP对白血病的治疗效果,并探讨其可能的作用机制。3结果3.1 TRYP对肿瘤细胞的抑制作用研究表明,在A549、HepG2、SW480、Eca-109、GRC-1、LNCAP、A375、K562等8种人源性肿瘤细胞中,K562细胞对TRYP的作用最为敏感,TRYP可明显抑制K562细胞增殖,且抑制作用呈现一定的浓度和时间依赖性。TRYP作用48h可诱导细胞形态和增殖周期发生明显改变;相差显微镜下,12.5μg/ml、25μg/ml TRYP组,细胞密度明显降低,大部分细胞边缘不清,亮度减弱,细胞出现溶解性死亡;透射电镜可见凋亡细胞增多,细胞核固缩,异染色质边集成新月状或环状,甚至坏死;Hoechst 33258染色荧光观察,正常组及溶媒对照组细胞核形态规则呈弥散均匀的荧光,而TRYP组细胞胞核内出现浓染致密的颗粒块状荧光,说明胞核固缩、染色质高度凝聚和碎裂。流式细胞术结果,TRYP可诱导K562细胞凋亡,48h后活细胞明显减少,凋亡和死亡细胞数明显上升,处于增殖活跃S期的细胞比例较对照组明显降低,尤其是25μg/ml TRYP组作用后,细胞S期比例降低至33.2%（P<0.01）,G0/G1期、G2/M期细胞比例明显增高,分别上升至52.6%（P<0.05）、14.3%（P<0.01）。3.2 TRYP抑制K562细胞的作用机制以6.25、12.5、25μg/ml TRYP处理K562细胞48 h后,细胞线粒体跨膜电位呈浓度依赖性下降,细胞中Bcl-2蛋白表达降低,而Bax蛋白的表达增强;胞浆中Cyt-c和细胞中caspase-3的表达也逐渐升高。其中以TRYP≥12.5μg/ml时,与空白对照相比作用显著;此外,25μg/ml TRYP还可抑制融合蛋白bcr/abl表达。利用SYBR Green RT-PCR方法检测上述蛋白在核酸水平的表达情况与Western blot方法检测到的结果较为一致。3.3 TRYP对小鼠白血病的治疗作用采用CTX预注射和尾静脉接种K562细胞建立SCID小鼠白血病模型。接种K562细胞3w后,模型组动物体重明显减轻并整体呈现恶液质,外周血白细胞数升高,外周血及骨髓涂片可见中晚幼粒细胞。经50mg/kg、25mg/kgTRYP及180mg/kgHu（阳性对照药）治疗后,小鼠一般状况比模型组有所改善,体重下降程度轻于模型组。FCM检测给药组小鼠与模型组相比骨髓组织中CD13表达明显降低（P<0.01）;骨髓中S期细胞比例下降;病理学观察发现给药后白血病细胞累及骨髓、脾、肝等脏器所引起的炎症反应有所改善,且50mg/kg组的疗效好于25mg/kg组。4结论采用荧光染色、透射电镜、流式细胞术等研究技术,证实TRYP对人白血病K562细胞及其诱发的白血病均具有显著抑制作用。其可能的作用机制,一是通过调节Bcl-2、Bax基因及蛋白的表达、降低线粒体跨膜电位、促使Cyt-c释放至胞浆,刺激下游分子caspase-3的活化引起K562细胞发生凋亡;二是TRYP通过抑制融合基因bcr/abl及蛋白的表达,导致K562细胞增殖抑制和凋亡。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 色胺酮的研究进展
• 2 肿瘤细胞凋亡的分子机制
• 3 人白血病模型在白血病研究中的应用
• 实验一 色胺酮对8 株人源性肿瘤细胞的MTT 及抑制K562 细胞增殖和诱导凋亡的研究
• 1 研究目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 实验二 色胺酮对K562 细胞作用机制研究
• 1 研究目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 实验三 色胺酮对小鼠K562 白血病的作用及其机制研究
• 1 研究目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢