苎麻种质资源遗传多样性及分子标记研究

论文摘要

苎麻（Boehmeria nivea L.Gaud）是我国最重要的韧皮纤维作物之一,在我国有着悠久的栽培和加工历史,加入WTO后,市场需求和麻纺工业的发展,对优良品种的需求越来越迫切。我国苎麻新品种选育虽然取得了较大的成绩,但如要进一步提高显得相当困难,其主要原因是缺乏有效的种质资源。此外,苎麻育种存在遗传背景复杂,缺少纯合的亲本材料,品种选育困难及育种周期长等问题。高代自交无性繁殖系是苎麻杂交育种极其珍贵的亲本材料,对其进行遗传多样性研究,有利于苎麻种质资源的收集、保存、鉴定和合理利用。我国野生种质资源十分丰富,但是很多尚未开发利用。因此,苎麻野生种和栽培种野生类型种质资源的考察、搜集、保存与鉴定,对于提高我国苎麻育种水平、促进苎麻产品的开发应用、研究苎麻的亲缘关系及起源等具有重要意义。本研究主要目的在于:（1）进行高代自交无性繁殖系的田间调查和聚类分析,筛选出农艺性状和品质性状均优良的材料,进一步丰富杂交育种亲本资源;（2）明确品质性状和农艺性状的某些内在联系,建立通过田间农艺性状调查来预测部分品质性状的回归方程;（3）建立适合苎麻自交无性繁殖系研究的RAPD、ISSR及SRAP等标记体系;进行苎麻自交无性繁殖系的遗传多样性分析,为亲本选配提供依据。（4）搜集一批苎麻野生种质资源,探索其种内、种间材料的遗传多样性和亲缘关系。分子标记能直接从DNA水平反映种质之间的遗传差异,是研究植物遗传多样性的有效工具。主要研究结果如下:1.应用SAS System for Windows V8.0统计分析软件,根据7个农艺性状和3个品质性状指标对供试90份自交无性繁殖系进行聚类。在Average Distance值为0.5时,可以将90份材料分为5个群,每个群又可以分为1-2亚组。研究表明在育种中,要选择纤维细度较优的自交无性繁殖系要在ClusterⅣ和ClusterⅤ两个群组种选择;而要选择产量高的育种材料则在ClusterⅡ群组内选择。通过聚类分析发现了纤维细度极优质的4份自交无性繁殖系材料（ClusterⅤ）,纤维细度超过2000m/g的22份材料（ClusterⅣ）,农艺性状优良,高产潜力大的13份自交无性繁殖系材料（ClusterⅡ）。通过田间数据调查分析得知,农艺性状及品质性状之间存在相关关系。建立的农艺性状及品质性状多元一次回归方程如下:y1=2800.82-1.41x1-525.18x2-73.15x3-3.20x4+8.56x5-675.51x6+2614.28x7+0.75x8y2=13.28+0.07x1-2.28x2+1.83x3-0.37x4-0.13x5+13.95x6-46.78x7-0.01x8y3=4.57+0.01x1+0.35x2-0.01x3-0.02x4-0.06x5-0.47x6+2.04x7y1表示纤维细度（m/g）;y2表示断裂强度（g）;y3表示断裂伸长率（%）。x1-x8分别表示株高（cm）、茎粗（cm）、功能叶片宽度（cm）、叶片长度（cm）、叶柄长（cm）、叶缘锯齿宽度（cm）、叶缘锯齿深度（cm）和有效分株率（%）。2.优化了苎麻RAPD分子标记体系;用32个RAPD引物对40份自交无性繁殖系材料的DNA进行PCR扩增,共扩增出113条带,多态性达到78.76%,Nei’s平均遗传距离为0.2317,平均Shannon指数为0.3568。Mantel检测得出的聚类结果和相似系数矩阵之间的相关系数为0.635,表明聚类结果很好的体现了种质之间的遗传关系。利用NTSYs 2.0软件进行主成分分析,累计贡献率为24.81%,第一主成分的贡献率为10.47%,结果表明主成分分析和RAPD聚类结果不是很吻合。3.优化了苎麻ISSR分子标记体系;30条ISSR引物对40份自交无性繁殖系材料的DNA模板进行扩增和电泳检测,总条带数为116条,多态性达到78.45%,Nei’s平均遗传距离为0.2405,平均Shannon指数为0.3679,每条引物扩增2-10条带不等。按照材料的地理位置,将40份自交无性繁殖系分为6个居群,多态位点百分率（pp）在23.28%-67.24%之间。Nei’s遗传距离在0.0964-0.2285之间,Shannon指数在0.1408-0.3310之间。第一、第二、第三主成分的贡献率分别为72.67%、5.36%和2.11%,累计贡献率为80.15%,结果表明主成分分析与采用ISSR进行聚类的结果十分一致。4.优化了苎麻SRAP分子标记体系;有72条引物均能扩增出有较高稳定性和重复性、丰富多态性的带型,条带总数为386条,多态性达到72.80%,Nei’s平均遗传距离为0.1889,平均Shannon指数为0.2969,每条引物扩增5-11条带不等。根据材料的地理位置,将35份自交无性繁殖系分为6个居群,多态位点百分率（pp）在19.71%-58.81%之间。Nei’s遗传距离在0.0794-0.1742之间,Shannon指数在0.1159-0.2699之间。第一、第二和第三主成分的贡献率分别为13.02%、8.47%和6.09%,累计贡献率为27.58%。只有部分聚类结果与采用UPGMA方法聚类得出的结果一致,研究结果表明,RAPD、ISSR和SRAP标记是进行研究苎麻自交无性繁殖系遗传多样性较好的方法。5.对2003-2007年采集到的45份荨麻科野生材料进行ITS序列分析,以绿叶种苎麻（B.nivea var.tenacissima）、艾麻（Laportea cuspidata）以及冷水花属3个种的ITS序列作为外类群。所得序列采用Clustal X程序进行对位排列,并经手工校正。利用MEGA3.1软件对序列进行分析。启发式搜索得到了最简约树,其中一棵树树长（tree length）777步,一致性指数（consistency index,CI）为0.6735,保留指数（reserved index,RI）为0.9407。聚类分析表明全部材料可以聚为4类7组,支持采用植物学性状分类的结果,两种不同聚类方法的分析结果基本一致:苎麻属（Boehmeria Jacq.）21份材料单独聚为一类,又可以分为3个亚组,第一亚组材料为序叶苎麻（B.clidemioides var.diffusa）,其自展支持率（bootstrap values）为89%,主要采集自神农架地区;第二亚组材料为水苎麻（B.macrophylla）;余下的7份白叶种苎麻（B.nivea L.）聚为一个亚组,主要包括栽培种及其栽培种野生类型。冷水花属（Pilea Lindl.）的3份材料作为外类群单独聚为一类,自展支持率为100%。采自云南丽江和湖北神农架的3份艾麻属（Laportea Gaudich.）材料单独聚为一类。蝎子草属（Girardinia Gaudich.）6份材料聚为一类。水麻属（Debregeasia Gaudich.）3个种共15份野生材料聚为一大类。此外,对38份野生材料进行的RAPD和ISSR聚类分析结果基本一致。

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摘要

Abstract

缩略词表

第一章文献综述

1 苎麻资源分布概况

2 苎麻野生种质资源的研究概况与应用价值

2.1 苎麻野生种质资源的收集评价概况

2.2 苎麻野生种质资源的保存

2.3 苎麻野生种质资源应用价值

3 苎麻种质资源评价研究进展

3.1 苎麻植物学特征

3.2 形态学标记研究

3.3 细胞学标记研究

3.4 生化标记研究

3.5 DNA分子标记研究

3.5.1 RAPD标记在苎麻属研究中的应用

3.5.2 ISSR标记在苎麻属研究中的应用

3.5.3 其它分子标记在苎麻属研究中的应用

4 存在的问题及展望

5 本研究拟解决的关键问题

第二章苎麻自交无性繁殖系农艺性状及品质性状评价

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 样品的准备

2.2.2 单纤维断裂强力与断裂伸长率的测定

2.2.3 纤维细度的测定

2.2.4 苎麻农艺性状的测定

3 结果与分析

3.1 不同自交无性繁殖系纤维品质性状分析

3.1.1 不同苎麻自交无性繁殖系材料单纤维强力

3.1.2 不同自交无性繁殖系材料纤维断裂伸长率

3.1.3 不同自交无性繁殖系材料纤维细度

3.2 不同自交无性繁殖系材料的农艺性状分析

3.2.1 不同苎麻自交无性繁殖系株高

3.2.2 不同苎麻自交无性繁殖系茎粗

3.2.3 不同苎麻自交无性繁殖系功能叶片宽度

3.2.4 不同苎麻自交无性繁殖系功能叶片长度

3.2.5 不同苎麻自交无性繁殖系功能叶叶柄长度

3.2.6 不同苎麻自交无性繁殖系功能叶叶缘锯齿宽度

3.2.7 不同苎麻自交无性繁殖系功能叶叶缘锯齿深度

3.2.8 不同苎麻自交无性繁殖系有效分株率

3.3 品质性状与农艺性状之间相关性

3.4 品质性状与农艺性状的通径分析

3.4.1 纤维细度与农艺性状的通径分析

3.4.2 纤维断裂强度与农艺性状的通径分析

3.4.3 纤维断裂伸长率与农艺性状的通径分析

4 小结与讨论

4.1 苎麻自交无性繁殖系主要性状指标分析

4.2 主要性状之间的相关分析

4.2.1 农艺性状与品质性状之间相关分析

4.2.2 品质性状之间相关分析

4.2.3 通径分析及回归模型的建立

4.3 自交无性繁殖系材料聚类分析

第三章苎麻自交无性繁殖系遗传多样性的RAPD分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试剂和仪器

2.3 基因组DNA的提取

2.4 PCR反应与产物检测

2.5 PCR反应体系的优化

2.6 苎麻自交无性繁殖系RAPD标记的数据处理与分析方法

2.6.1 遗传多样性参数计算

2.6.2 RAPD标记的聚类分析

2.6.3 RAPD标记的主成分分析

3 结果与分析

3.1 DNA的提取

3.2 RAPD反应体系优化

3.2.1 DNA的浓度对PCR结果的影响

2+对PCR结果的影响'>3.2.2 dNTP浓度和Mg²⁺对PCR结果的影响

2+对PCR结果的影响'>3.2.3 引物浓度和Mg²⁺对PCR结果的影响

3.2.4 TaqDNA聚合酶的纯度和用量对PCR结果的影响

3.3 RAPD方法扩增程序的优化

3.3.1 退火温度对扩增的影响

3.3.2 循环次数对扩增的影响

3.4 苎麻自交无性繁殖系的RAPD扩增及聚类分析

3.5 苎麻自交无性繁殖系的RAPD标记的主成分分析

4 小结与讨论

4.1 DNA的提取

4.2 RAPD反应体系的优化

4.3 RAPD扩增程序的优化

4.4 苎麻自交无性繁殖系的RAPD聚类分析

第四章苎麻自交无性繁殖系遗传多样性的ISSR分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试剂和仪器

2.3 基因组DNA的提取

2.4 PCR反应与产物检测

2.5 PCR反应体系的优化

2.6 苎麻自交无性繁殖系的ISSR扩增及聚类分析

3 结果与分析

3.1 ISSR反应体系优化

3.1.1 DNA的浓度对PCR结果的影响

2+对PCR结果的影响'>3.1.2 dNTP浓度和Mg²⁺对PCR结果的影响

2+对PCR结果的影响'>3.1.3 引物浓度和Mg²⁺对PCR结果的影响

3.1.4 TaqDNA聚合酶的纯度和用量对PCR结果的影响

3.2 ISSR方法扩增程序的优化

3.2.1 退火温度对扩增的影响

3.2.2 循环次数对扩增的影响

3.3 苎麻自交无性繁殖系的ISSR扩增及聚类分析

3.4 苎麻自交无性繁殖系ISSR标记的主成分分析

4 小结与讨论

4.1 DNA的提取

4.2 ISSR反应体系的优化

4.3 ISSR扩增程序的优化

4.4 苎麻自交无性繁殖系的ISSR聚类分析

第五章苎麻自交无性繁殖系遗传多样性的SRAP分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试剂和仪器

2.3 基因组DNA的提取

2.4 PCR反应与产物检测

2.5 SRAP-PCR反应体系的优化

2.6 苎麻自交无性繁殖系的SRAP扩增及聚类分析

3 结果与分析

3.1 SRAP反应体系优化

3.1.1 DNA的浓度对SRAP-PCR结果的影响

2+对SRAP-PCR结果的影响'>3.1.2 dNTP浓度和Mg²⁺对SRAP-PCR结果的影响

2+对SRAP-PCR结果的影响'>3.1.3 引物浓度和Mg²⁺对SRAP-PCR结果的影响

3.1.4 TaqDNA聚合酶的纯度和用量对SRAP-PCR结果的影响

3.2 SRAP方法扩增程序的优化

3.2.1 退火温度对扩增的影响

3.2.2 循环次数对扩增的影响

3.2.3 SRAP-PCR体系及反应参数的稳定性检测结果

3.3 苎麻自交无性繁殖系的SRAP扩增及聚类分析

3.4 苎麻自交无性繁殖系的SRAP标记的主成分分析

4 小结与讨论

4.1 SRAP反应体系的优化

4.2 SRAP扩增程序的优化

4.3 苎麻自交无性繁殖系的SRAP聚类分析

第六章苎麻属野生材料的ITS、RAPD及ISSR分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 DNA提取

2.2.2 PCR扩增

2.2.3 克隆测序

2.2.4 数据分析

3 结果与分析

3.1 ITS目的片段扩增

3.2 ITS序列与Alignment

3.3 荨麻科部分属间ITS序列分析

3.4 荨麻科部分属间系统发育分析

3.5 部分苎麻属野生材料的RAPD和ISSR聚类分析

4 讨论

第七章主要结论及研究展望

1 主要结论

1.1 筛选到40份适合不同育种目标的自交无性繁殖系材料

1.2 研究了40份自交无性繁殖系的遗传多样性

1.3 进行了45份野生材料的ITS序列分析和遗传多样性研究

1.4 研究了38份（4个种）苎麻属野生材料的遗传多样性

2 研究展望

参考文献

附录1:主要试剂配制

附录2:SRAP分析及结果的PAGE检测

附录3:在校期间已发表学术论文

致谢

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