脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆蛋白聚集机理

论文摘要

各种大豆蛋白均以脱脂大豆为原料制备,但脱脂豆粕中残留的不饱和脂质容易在脂肪氧合酶的催化下发生氧化,且脂质-蛋白质体系中的氧化脂质易诱导蛋白质聚集,从而引起蛋白质的营养和功能性质发生不期望的变化。因大豆蛋白聚集而涉及的内容很多,本文重点研究由脂肪氧合酶催化亚油酸诱导大豆蛋白聚集的机理。通过建立由亚油酸、脂肪氧合酶和低脂质含量的大豆蛋白所组成的模拟反应体系,应用化学分析、电泳、凝胶色谱和激光光散射等方法研究了反应后大豆蛋白的聚集情况。结果发现,在模拟体系中同时添加亚油酸和脂肪氧合酶会使反应后样品的混浊度与表面疏水性增加,巯基与二硫键的含量下降。SDS-PAGE显示大豆蛋白7S和11S的各个亚基均参与了反应,尤其是7S部分反应更为明显,表明聚集体的形成涉及包括二硫键在内的共价交联。原态电泳、凝胶色谱和激光光散射分析进一步证实,反应后的大豆蛋白形成了相对高分子质量和颗粒粒径较大的聚集体。采用荧光光谱结合蛋白质氧化值、氨基酸组成、TBA值、GC-MS和可溶蛋白质的表面疏水性等分析,探讨了脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白的相互作用。在脂肪氧合酶的催化作用下,亚油酸氧化产生的氢过氧化物及其降解产物与大豆蛋白作用,反应后大豆蛋白的荧光光谱最大激发波长在350 nm,最大发射波长在440 nm。脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白的相互作用,在LRSP+LA+LOX模拟体系中产生荧光物质。该荧光物质部分可溶于氯仿-甲醇溶液的有机相中,其荧光光谱最大激发波长在350 nm,最大发射波长在430 nm,且荧光强度随着反应程度的增加而增强。伴随着荧光物质的形成,反应后大豆蛋白的蛋白质氧化值增加,可溶性蛋白质的表面疏水性降低,色氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和半胱氨酸（胱氨酸）等氨基酸含量减少,蛋白质分子间形成C-C或C-N形式的共价交联并进一步导致大豆蛋白聚集。导致大豆蛋白聚集体形成的自由基由氧化亚油酸到大豆蛋白的迁移以及部分自由基类型的确定是通过电子顺磁共振（EPR）研究完成的。经脂肪氧合酶催化亚油酸的诱导,在大豆蛋白EPR波谱中检测到一个很强的源于肽链骨架α-碳原子或其侧链其它碳原子的自由基信号,其g值范围在2.0041-2.0054之间。此外,在碳自由基中场信号的低场区尚有一个额外的肩峰,它是硫自由基信号,其g值范围在2.019-2.028之间。在大豆蛋白发生上述变化的同时伴随着荧光强度的增加,表明蛋白分子之间和/或之内产生了共价交联。在大豆蛋白与脂肪氧合酶和亚油酸混合反应前,添加抗氧化剂能抑制自由基信号和荧光的发展;可使中场碳自由基信号降低35-65%。除了上述提及的自由基之外,通过改变微波功率测量EPR波谱,又确定了两种类型的自由基。具有较高反应活性的羟基自由基（?OH）源于自由基链反应和水分子;醛自由基源于大豆蛋白与脂肪氧合酶催化亚油酸氧化产生的降解产物的酶促反应。应用傅立叶变换红外、激光拉曼和圆二色性光谱等方法研究了不同亚油酸浓度下脂

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 大豆脂肪氧合酶结构、性质及其对食品品质的影响
• 1.1.1 LOX 对食品品质的影响
• 1.1.2 大豆脂肪氧合酶的结构及其性质
• 1.2 脂质过氧化及与氨基酸和蛋白质的相互作用
• 1.2.1 自由基、自由基链反应及其自由基检测方法
• 1.2.2 脂质过氧化作用对生命体的损伤
• 1.2.3 过氧化脂质与氨基酸的相互作用
• 1.2.4 过氧化脂质与蛋白质的相互作用
• 1.3 LOX 诱导脂质氧化与大豆制品品质的关系
• 1.3.1 LOX 诱导的脂质氧化对大豆制品风味的影响
• 1.3.2 LOX 诱导的脂质氧化对大豆制品品质的影响
• 1.4 立题背景和意义
• 1.5 本课题研究的主要内容
• 参考文献
• 第二章 脂肪氧合酶催化亚油酸氧化诱导大豆蛋白的聚集
• 2.1 前言
• 2.2 材料与设备
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 热处理对LOX 活力的影响
• 2.4.2 巯基和二硫键的含量
• 2.4.3 蛋白质的表面疏水性
• 2.4.4 蛋白质的凝胶电泳
• 2.4.4.1 SDS-PAGE
• 2.4.4.2 无巯基乙醇和SDS 的原态电泳
• 2.4.5 蛋白质的凝胶色谱
• 2.4.6 粒度分布
• 2.4.7 蛋白质溶液的混浊度
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白的相互作用研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与设备
• 3.3 实验方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 大豆蛋白内源性荧光光谱的分析比较
• 3.4.2 脱脂前后的大豆蛋白激发光谱和发射光谱的分析比较
• 3.4.3 大豆蛋白氯仿-甲醇萃取液激发光谱和发射光谱的比较分析
• 3.4.4 蛋白质的氧化值
• 3.4.5 大豆蛋白的氨基酸组成分析
• 3.4.6 LOX 催化LA 产生过氧化产物的TBA 分析
• 3.4.7 LOX 催化LA 过氧化次生产物的GC-MS 分析
• 3.4.8 可溶性蛋白的表面疏水性分析
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白相互作用过程中自由基迁移的电子顺磁共振研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与设备
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 LA、氧化LA 和LOX 催化LA 产生的LA 过氧化产物的EPR 波谱
• 4.4.2 没有添加抗氧化剂的大豆蛋白EPR 波谱
• 4.4.3 添加抗氧化剂的大豆蛋白EPR 波谱
• 4.4.4 自由基类型的确定
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 脂肪氧合酶催化亚油酸氧化对大豆蛋白结构的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与设备
• 5.3 实验方法
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 FT-IR 光谱分析
• 5.4.2 Raman 光谱分析
• 5.4.2.1 巯基和二硫键的分析
• 5.4.2.2 芳族氨基酸的分析
• 5.4.2.3 二级结构的分析
• 5.4.3 CD 光谱分析
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 脂肪氧合酶催化亚油酸氧化对酸沉大豆蛋白性质的影响
• 6.1 前言
• 6.2 材料与设备
• 6.3 实验方法
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 酸沉大豆蛋白等电点聚集沉淀颗粒的SEM 分析
• 6.4.2 酸沉大豆蛋白的毛细管电泳
• 6.4.3 酸沉大豆蛋白的紫外吸收光谱
• 6.4.4 酸沉大豆蛋白的凝胶体积排阻色谱
• 6.4.5 溶液中酸沉大豆蛋白的颗粒粒径分布
• 6.4.6 酸沉大豆蛋白溶液的特性粘度
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 附录