大鼠气管干细胞增殖分化过程中Notch信号分子的表达及意义

论文摘要

前言成体干细胞数量稀少但对机体却至关重要,它们是生后机体损伤修复、自我更新的重要来源。气管上皮存在着气管干细胞,它对气管上皮的损伤修复和自我更新及多种呼吸系统疾病具有重要意义,但由于气管上皮结构的复杂性及所处微环境的特殊性,气管干细胞的研究进展极为缓慢。利用经典的5-FU打击的方法,我们在体外建立了气管上皮再生修复的模型,这一模型成功再现了气管干细胞的增殖分化过程,使气管干细胞增殖分化机制的初步研究成为可能。离体气管在5-FU的作用下,增殖期细胞脱落,基底膜上仅残余散在分布的GO期细胞;去除5-FU作用后,气管上皮经裸核样细胞、扁平细胞、立方细胞,至48-72h时,基本恢复气管上皮的假复层纤毛上皮正常结构。可见,5-FU作用后的GO期细胞中含有气管干细胞,气管上皮的修复过程正是通过气管干细胞的增殖分化完成的,先前的研究已经证实了这一点。但我们对这一过程的调控机制还所知甚少。Notch是脊椎动物和无脊椎动物发育过程中一类十分重要的信号受体蛋白家族,它通过与邻近细胞间的相互作用来精确调控各谱系细胞的分化、增殖和凋亡,进而决定细胞命运和发育过程,其表达与功能具有组织特异性。近年来研究报道,Notch信号通路在干细胞增殖分化过程中起着重要的作用,Notch信号对气管干细胞增殖分化的作用尚未阐明。本研究利用5-FU介导的大鼠气管上皮损伤修复模型,检测了大鼠气管干细胞增殖分化过程中Notch信号分子的表达及意义。材料和方法1、离体大鼠气管损伤修复模型的制备及DAPT和Jag-1处理取约200克左右的Wistar大鼠,雌雄不限,水合氯醛麻醉,无菌条件下取出气管,PBS冲洗,置于DMEM/F12培养液中（含10%胎牛血清）。取正常气管,剪取一气管环固定,留做石蜡切片,灌入蛋白酶ⅩⅣ（0.5mg/ml）,结扎另一端,4℃消化过夜,收集消化液,加FCS至终浓度为2.5%终止酶反应收集正,常气管上皮细胞于2mlEppendorf管中,-70℃冻存,留做mRNA。其余气管组织分为DAPT预处理组、Jag-1预处理组、对照组、DAPT处理组和Jag-1处理组。DAPT及Jag-1预处理组先在培养液中加入5μM DAPT或40μM Jag-1,37℃,5%CO2孵育12小时,弃去上述培养液,于DMEM/F12（含10%胎牛血清）培养液中加入终浓度为120mg/ml的5-FU,37℃,5%CO2孵育12小时,弃去上述培养液,换成新鲜DMEM/F12液（含10%胎牛血清）;对照组单纯5-FU作用;DAPT处理组和Jag-1处理组在5-FU作用后换为含有5μM DAPT或40μM Jag-1的DMEM/F12（含10%胎牛血清）继续培养,方法同上,分别于换液后0、3、6、12、24、48小时取出气管组织分别固定,留做石蜡切片;消化,收集细胞于2mlEppendorf管中,—70℃保存,以备RNA和蛋白提取。2、RT-PCR检测按TrizolTM试剂使用说明提取气管上皮细胞总RNA,检测它的浓度,纯度和完整性。按逆转录试剂盒使用说明操作,选用Oligo—dT做引物合成第一链cDNA,逆转录条件为:30℃10min,40℃40min,99℃5min,5℃5min;PCR反应条件为:94℃变性2min后,94℃30s,退火,72℃1min,进行30个循环,最后于72℃延伸7min。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色分析表达结果,测灰度值,统计。相同条件下用β-actin作为内对照。3、蛋白印迹检测按蛋白抽提试剂盒说明抽提气管上皮细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳,50V恒压湿转120mins,BSA室温封闭2hrs,一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2hrs,DAB显色。转膜后各步之间均用洗膜液洗膜3次,每次5mins。相同条件下用β-actin作为内对照。4、间接免疫荧光检测气管上皮ABCG2,CK19,Notch3和Jagged1的表达连续切片,石蜡切片脱蜡至水,抗原修复,非免疫动物血清封闭,一抗分别为Goat anti-ABCG2,Rabbit anti-CK19,Rabbit anti-Notch3和Goat anti-Jagged1;二抗分别TRITC标记Rabbit anti Goat IgG和FITC标记Goat anti Rabbit IgG。DAPI复染细胞核。50%缓冲甘油封片,荧光显微镜OlympasBX51下观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗,其余步骤同前。5、统计分析所有的RT-PCR实验和蛋白印迹实验均独立重复三次,所得数据的值用均数（means）±标准偏差（SD）来表示。用SPSS 11.5软件对所得数据进行单因素方差分析,当P＜0.05认为有统计学意义。结果1、5-FU诱导损伤修复过程中ABCG2、CK19和PCNA的表达变化正常气管上皮几乎没有ABCG2表达,去除5-FU作用后Oh,ABCG2少量表达,随后表达量逐渐增高,至6h达到峰值,随后逐渐降低,至48h几乎恢复正常水平;正常气管上皮CK19高表达,去除5-FU作用后Oh,CK19表达极微量,之后表达逐渐增加,至12h后CK19表达量迅速上升,至48h几乎恢复正常水平;正常气管上皮PCNA微量表达,去除5-FU作用后Oh表达量仍然很低。3h后PCNA开始表达并逐渐增高,至6h达到峰值,随后下降,至48h时,基本恢复正常水平。2、Notch信号分子在大鼠气管上皮的表达RT-PCR结果显示,正常大鼠气管上皮中Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2均有表达;Notch-2、Jagged-2、Hes3和Hes5在正常气管上皮及去除5-FU作用后气管干细胞增殖分化过程中均没有明显表达。Notch-3、Jagged-1和Hey1在5-FU打击修复过程中表达量有显著差异。3、5-FU诱导损伤修复过程中N3ICD,Jagged1及Hey1的表达变化蛋白印迹检测大鼠气管上皮损伤修复过程中N3ICD,Jagged1及Hey1的蛋白水平发现,正常气管上皮N3ICD、Jagged-1和Heyl仅有微量表达。5-FU打击后Oh,其表达增高,并随着气管上皮的修复逐渐增加,分别在6h、6h和12h达到高峰,随后逐渐降低,至48-72h降至正常水平。4、间接免疫荧光检测5-FU作用后大鼠气管上皮和Jagged1、Notch3、ABCG2和CK19的表达Jagged1为膜表达,多表达于上皮基底侧。打击后Oh,气管上皮可见少量Jagged1阳性细胞,随气管上皮的修复逐渐增多,至6h Jagged1阳性细胞最多,随后Jagged1蛋白表达逐渐减少,至48h,接近恢复正常水平。正常气管上皮Notch3绝大部分为膜阳性,5-FU打击后Oh,Notch3核阳性细胞增多,至6h达到高峰,随后降低,至48h仅见极少的核阳性细胞。大部分Jagged-1阳性细胞与Notch3核阳性细胞相邻,并分布与气管上皮的相似区域。ABCG2和CK19均为膜表达,表达于气管上皮不同的细胞,变化规律与Western blot结果一致,绝大部分ABCG2阳性细胞为Notch3核阳性细胞。5、DAPT阻断和Jag-1持续激活Notch信号通路对大鼠气管上皮损伤修复的影响免疫印迹结果显示,DAPT处理后6小时Notch通路活性明显低于对照组,24h时Notch通路几乎完全失活。DAPT阻断后,ABCG2增高幅度下降,并于6h后显著低于对照组;K19表达持续增高,并于6h后显著高于对照组,至24h时基本达到正常水平,并持续高表达;PCNA增高幅度下降,6h后显著低于对照组,至24h时已几乎检测不多PCNA的表达。Jag-1持续激活Notch通路,ABCG2增高幅度升高,并于6h后显著高于对照组;CK19表达降低,并于6h后显著低于对照组;PCNA增高幅度上升,6h后显著高于对照组。HE染色显示,5-FU诱导损伤后,用DAPT阻断Notch通路,与单纯5-FU作用的对照组相比,气管上皮的形态于6h开始出现差异。此时,大部分气管上皮细胞已呈立方状;12h,可见纤毛出现在气管上皮;12h—48h细胞没有明显增加,气管上皮呈单层立法上皮,被覆纤毛。用Jag-1持续激活Ntoch通路的情况下,细胞增加迅速,但始终未见纤毛出现,48h后,气管上皮没有恢复假覆层纤毛柱状上皮的结构。6、DAPT及Jag-1预处理对大鼠气管上皮损伤修复的影响正常气管上皮经DAPT预处理后,细胞数量明显减少。再经5-FU作用后,气管上皮细胞几乎全部脱落,没有细胞残留。经48h后,气管上皮仍没有修复的迹象。正常大鼠气管上皮经Jag-1预处理后,纤毛细胞明显减少。再经5-FU作用后,气管基底膜上残留细胞数量增加,并于24h时基本恢复了假覆层纤毛柱状上皮的结构。免疫荧光显示,正常气管上皮ABCG2（+）细胞数量稀少;经DAPT预处理后,气管上皮未见ABCG2阳性细胞。经Jag-1预处理后,气管上皮ABCG2阳性细胞数量增加。结论1、5-FU作用后48h,气管上皮形态及增殖分化状态基本恢复正常水平;2、Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2可能参与了正常大鼠气管上皮稳态的维持;3、Notch-3、Jagged-1和Hey1可能在气管干细胞增殖分化的过程中发挥了作用;4、Notch信号对气管干细胞未分化状态的维持及增殖起着重要的作用,是气管上皮损伤修复所不可缺少的。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 论文二
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介