重组精氨酸脱亚胺酶的异源表达、纯化及性质研究

论文摘要

精氨酸脱亚胺酶（Arginine deiminase,EC 3.5.3.6）简称ADI,广泛存在于细菌、古细菌、厌氧真核生物中,是ADI途径精氨酸降解的第一个酶,在精氨酸缺陷型肿瘤、白血病治疗等方面具有广泛的应用前景,但目前用于临床试验的重组ADI主要来源于支原体,生物安全方面存在着一定的隐患,所以开发一种既具有高活性,又没有生物安全隐患的ADI具有非常重要的意义。本研究通过PCR技术获得了变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039）ADI基因序列,并对其进行了序列测定和分析。测序结果显示,基因开放阅读框为1254 bp,编码417个氨基酸,推测蛋白质大小为46.5 kDa。Blast分析显示它与恶臭假单胞菌（P. putida）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）同源性分别高达97 %和85 %。将获得的ADI基因片段克隆到pMD18-T载体上,酶切后与表达载体pET28a进行连接,构建了重组表达载体pET28a-ADI,并将其转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE与Western Blot分析证明重组ADI基因获得了表达,酶活测定证明其具有一定活性。通过初步诱导条件优化,确定了诱导剂IPTG最适浓度0.4 mM,诱导时间4 h,诱导温度30℃,并通过超声波破碎,SDS-PAGE分析证实了包涵体的存在。利用镍琼脂糖凝胶亲和层析实现了重组ADI的一步纯化,SDS-PAGE分析显示纯化蛋白分子量大小约为49 kDa,与推测大小相符,纯化蛋白比酶活4.76 U/mg。分别考察了pH、温度、金属离子、化学试剂对重组ADI活性的影响,同时考察了它的温度稳定性,测定了酶动力学参数。结果显示重组ADI最适pH为6.0,最适反应温度37℃;除铜离子对重组ADI酶活性有很强的抑制作用外,其他金属离子和化学试剂对重组ADI影响不明显;重组ADI对温度比较敏感,稳定性不高;经测定动力学参数分别为Vmax= 4.92μmol/min·mg,Km= 96.09 mM,推知重组ADI与底物结合力较低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 精氨酸脱亚胺酶的概述
• 1.1.1 精氨酸脱亚胺酶的来源
• 1.1.2 精氨酸脱亚胺酶的理化性质
• 1.1.3 精氨酸脱亚胺酶的代谢机制
• 1.1.4 精氨酸脱亚胺酶的用途
• 1.2 精氨酸脱亚胺酶研究进展
• 1.2.1 精氨酸脱亚胺酶的抗肿瘤活性
• 1.2.2 精氨酸脱亚胺酶的克隆与表达
• 1.3 大肠杆菌表达系统
• 1.3.1 大肠杆菌表达系统概述
• 1.3.2 pET 表达系统
• 1.4 本课题研究背景、意义和课题来源
• 1.5 本课题的研究思路和内容
• 第二章 精氨酸脱亚胺酶的克隆与序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株、载体和培养基
• 2.2.2 主要试剂和缓冲液
• 2.2.3 主要设备
• 2.2.4 PCR 扩增目标基因
• 2.2.5 DNA 操作
• 2.2.6 克隆载体的构建
• 2.2.7 重组质粒的筛选和验证
• 2.2.8 基因序列的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 变形假单胞菌基因组DNA 的提取
• 2.3.2 精氨酸脱亚胺酶基因的PCR 扩增
• 2.3.3 克隆载体pGEM-ADI 的构建
• 2.3.4 精氨酸脱亚胺酶基因序列分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 精氨酸脱亚胺酶大肠杆菌表达载体的构建及其表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株、载体和培养基
• 3.2.2 主要试剂、工具酶和缓冲液
• 3.2.3 主要设备
• 3.2.4 PCR 扩增目标基因
• 3.2.5 DNA 操作
• 3.2.6 大肠杆菌表达载体的构建
• 3.2.7 表达载体的筛选和酶切鉴定
• 3.2.8 基因序列的测定
• 3.2.9 摇瓶诱导表达及表达条件的初步优化
• 3.2.10 SDS-PAGE 凝胶电泳
• 3.2.11 表达产物Western Blot 鉴定
• 3.2.12 酶活测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 精氨酸脱亚胺酶基因的PCR 扩增
• 3.3.2 重组表达载体pET28a-ADI 的构建
• 3.3.3 表达载体的筛选与酶切验证
• 3.3.4 基因序列的测定
• 3.3.5 重组子E. coli BL21（pET28a-ADI）的诱导表达及其条件的初步优化
• 3.3.6 重组蛋白的Western Blot 鉴定
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组精氨酸脱亚胺酶的纯化与酶学性质研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株与培养基
• 4.2.2 主要试剂和缓冲液
• 4.2.3 主要设备
• 4.2.4 重组精氨酸脱亚胺酶亲和纯化
• 4.2.4.1 样品的制备
• 4.2.4.2 镍柱亲和层析
• 4.2.4.3 蛋白质浓度的确定
• 4.2.4.4 纯化蛋白SDS-PAGE
• 4.2.5 酶活的测定
• 4.2.5.1 纯化蛋白酶活的测定
• 4.2.5.2 酶学性质实验相对酶活的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组精氨酸脱亚胺酶亲和纯化
• 4.3.2 重组精氨酸脱亚胺酶的酶学性质
• 4.3.2.1 pH 对重组精氨酸脱亚胺酶活性的影响
• 4.3.2.2 温度对重组精氨酸脱亚胺酶活性的影响
• 4.3.2.3 重组精氨酸脱亚胺酶温度稳定性的研究
• 4.3.2.4 金属离子对重组精氨酸脱亚胺酶活性的影响
• 4.3.2.5 化学试剂对重组精氨酸脱亚胺酶活性的影响
• 4.3.2.6 重组精氨酸脱亚胺酶酶反应动力学参数的测定
• 4.4 本章小结
• 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2：基因序列测定