论文摘要
目的：内皮祖细胞（Endothelial progenitor eells） EPCs是内皮细胞的前体细胞,血管内皮细胞损伤是各种心血管疾病的始动环节和中心环节,EPCs不仅参与人体胚胎血管的生成,同时还有维持内皮细胞的完整性和血管动态平衡的功能。EPCs的减少和功能减退被认为是未来心血管事件的预测因子。内皮的损伤与修复之间的动态平衡是维持其正常功能的关键,EPCs是参与修复的重要因素。通心络依据中药络病理论研究制成。研究证实通心络能显著改善冠心病患者血管内皮功能,稳定斑块,延缓动脉粥样硬化进程,改善冠心病患者心绞痛症状,改善心肌缺血,目前已广泛应用于临床心脑血管疾病的预防和治疗。考虑通心络可能通过影响EPCs促进内皮功能的改善,本试验观察人外周血EPCs培养生长的特征,探讨改进人外周血EPCs分离和体外培养的技术,找寻细胞的最佳干预期,探索人外周血EPCs体外诱导培养和扩增的方法。证实人外周血是临床治疗缺血性疾病一个理想的EPCs来源,为人外周血EPCs的研究奠定基础。同时,研究通心络对体外培养的人外周EPCs黏附、增殖功能的影响,为临床冠心病的治疗中通心络的合理应用提供参考。方法：本研究方法围绕着EPCs分为相互关联的两部分：1.人外周血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定：无菌条件下采集冠心病患者外周血10ml,运用Ficoll密度梯度离心法,分离外周血中单个核细胞（MNCs）,用含有10%优级胎牛血清的人EPCs培养基进行培养。对培养所得的细胞每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长的形态学变化,评价细胞的生长过程；并进行EPCs特征和功能的鉴定：经激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs;流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133进一步鉴定为EPCs。2.通心络对内皮祖细胞功能的影响：在第一部分研究的基础上,选择培养7天的细胞进行这一步研究。将培养7天的细胞消化,重悬,收集贴壁细胞,贴壁细胞随机分成7组：（1）对照组；（2）冠心病患者各浓度组（共6组）：在培养液中加入终浓度为50、100、200、500、750和1000μg/ml培养48h,其中500μg/ml组观察不同时间（Oh、12h、24h、36h、48h）。流式细胞仪检测细胞表型；黏附能力测定实验检测EPCs的黏附能力；MTT比色法检测EPCs的增殖能力。结果：1.将离心速度调整至1500rpm后,每毫升外周血经Ficoll密度梯度离心法分离可得到MNCs 1x106-2x106个,台盼蓝染色后活细胞百分率在96±2%。培养后早期细胞大多为圆形或椭圆形,混有少量纺锤形细胞,第5天起,部分圆形大单核细胞转化为梭形贴壁内皮祖细胞；7天左右出现由数十个细胞形成的细胞集落,并可见到细胞呈条索状排列；10天左右,细胞变为长梭形,相互交联；14天后细胞开始衰老、崩解,数量减少。在培养的第7天,细胞生长性状最佳,通过检测,细胞的内皮祖细胞系特异性标志因子CD34、CD133表达良好,摄取acLDL和结合UEA-I实验均呈强阳性。2.通心络对外周血EPCs黏附能力的影响：通心络明显增加EPCs的黏附能力,呈一定的量效与时效关系,在100μg/ml浓度时开始较对照组明显增强（P<0.05）,于500μg/ml时达最大效应（P<0.05）。500μg/ml作用24h后,EPCs黏附能力开始明显增强（P<0.05）,48h达到高峰（P<0.05）。3.通心络对外周血EPCs增殖的影响：通心络明显增加EPCs的增殖能力,呈一定的量效与时效关系,在100μg/ml浓度时开始较对照组明显增强（P<0.05）,于500μg/ml时达最大效应（P<0.05）。500μg/ml通心络作用24h后,EPCs增殖能力开始明显增强（P<0.05）,48h达到高峰（P<0.05）。结论：1、在26～37℃条件下,采用离心速度为1200rpm-1500rpm的密度梯度离心法,可以良好的分离人外周血单个核细胞,以满足EPCs培养的需要。2、内皮祖细胞的表型鉴定和活性测定显示其旺盛生长期在培养后的第7-10天,在此期间,其增殖活跃,生长情况较好,是进一步进行研究的最佳时期。3.通心络能显著改善外周血内皮祖细胞黏附、增殖能力,呈一定的量效和时效关系,这可能是通心络防治心脑血管疾病的新机制。