HCVp7蛋白反式调节基因p7TP2生物学功能的研究

论文摘要

目前世界上有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,危害严重,但目前还没有特效的治疗技术和方法。找出肝细胞中与HCV反式调节相关的基因,并进一步弄清具体作用机制、作用效应及连带影响,对明确HCV的致病机理,寻找有效防治方法有重要意义。HCV p7TP2是利用基因芯片筛选的HCV p7蛋白下调表达的靶基因,其许多功能仍需要进一步研究。本试验主要应用酵母双杂交技术、抑制性消减杂交技术、原核表达技术、实时荧光定量PCR等方法研究p7TP2基因的生物学功能。1.以HepG2细胞cDNA为模板克隆出p7TP2基因,编码区为495bp （核苷酸）,应用生物信息学分析此基因位于8q24.3,半衰期为30h,属于不稳定蛋白,疏水指数较高,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域。2.应用实时荧光定量PCR验证HCV p7蛋白下调p7TP2基因的表达,并应用抑制性消减杂交筛选并构建p7TP2下调表达基因的消减文库,同源性分析p7TP2下调表达的基因主要位于线粒体,并与调控细胞增殖、分化、凋亡的信号传导通路有关。3.利用原核表达系统,构建融合表达载体,IPTG诱导表达融合蛋白,证明其相对分子量约为33000,纯化融合蛋白,并免疫兔子,制备多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质免疫印迹,此抗体具有较高效价和特异性。4.免疫组织化学检测p7TP2蛋白在阳性组织中分布在细胞浆,且在正常组织的表达量比病理组织高。构建绿色荧光蛋白GFP与p7TP2的融合基因,转入不同的细胞系HepG2及COS-7,荧光显微镜观察其亚细胞定位,显示荧光主要集中在细胞浆。5.应用酵母双杂交系统,构建诱饵质粒pGBKT7-p7TP2,转化酵母细胞AH109,并与转化人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187配合,在营养缺陷型培养基和X-α-gal上进行双重筛选,测序,并进行生物信息学分析。结果显示p7TP2蛋白与一些直接和间接与抗凝血因子有关的蛋白基因具有相互作用,推测p7TP2蛋白可能直接或间接参与抗凝血过程。6.选取p7TP2基因起始密码子ATG上游1203bp下游147bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆并构建载体pCAT3-p7TP2-p和PGLB-p7TP2-p,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测显示在不同的细胞系HepG2和Huh-7中均具有启动子活性;共转染试验显示HCV p7对p7TP2启动子活性具有下调作用。上述结论为进一步研究p7TP2基因的结构和功能提供了新的线索,也为HCV p7的反式调节作用及HCV发病机制研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 新基因功能研究的策略与方法
• 1.1 新基因的生物信息学分析
• 1.1.1 核酸序列分析
• 1.1.2 蛋白质结构与功能预测及方法
• 1.2 新基因功能研究策略
• 1.2.1 mRNA 水平的表达谱分析
• 1.2.2 蛋白质水平的表达分析
• 1.2.3 基因编码蛋白相互作用的研究
• 1.2.4 差异表达基因的研究方法
• 1.3 基因功能失活策略
• 试验研究
• 第二章 HCV p7 蛋白反式调节基因 p7TP2 的 克隆及生物信息学分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 p7TP2 的全长编码序列的确定
• 2.2.2 p7TP2 基因的PCR 扩增及序列鉴定
• 2.2.3 pcDNA3.1/myc-HisA-p7TP2 载体构建
• 2.2.4 p7TP2 基因生物信息学分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 实时荧光定量 PCR 验证 HCV p7 下调 p7TP2 基因的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞、质粒及主要试剂
• 3.1.2 细胞培养
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 实时荧光定量PCR 细胞转染及总RNA 提取
• 3.2.2 熔解曲线分析
• 3.2.3 实时荧光定量PCR 试验结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 应用抑制性消减杂交技术筛选 p7TP2 反式调节基因
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细胞、质粒及主要试剂
• 4.1.2 细胞转染及mRNA 提取
• 4.1.3 消减杂交文库的建立
• 4.1.4 消减文库扩增及克隆鉴定分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 提取细胞mRNA 的定性、定量分析
• 4.2.2 dscDNA 两端连接效率检测
• 4.2.3 cDNA 消减文库消减效率的鉴定
• 4.2.4 差异表达cDNA 片断的扩增及克隆
• 4.2.5 cDNA 测序与同源性分析初步结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 HCV p7TP2 融合蛋白表达及多克隆抗体的制备及检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 大肠杆菌稀有密码子分析
• 5.2.2 p7TP2 基因的PCR 扩增与pET-32a（+）-p7TP2 载体的构建
• 5.2.3 pET-32a（+）-p7TP2 质粒转化大肠杆菌Rosetta-gamiB 菌的鉴定分析
• 5.2.4 p7TP2 蛋白的原核表达、Western 免疫印迹分析及纯化
• 5.2.5 多克隆抗体的制备和鉴定
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 酵母双杂交技术筛选与 p7TP2 蛋白结合的 肝细胞蛋白编码基因
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 pGBKT7-p7TP2 饵载体的鉴定
• 6.2.2 p7TP2 蛋白在酵母菌株的表达
• 6.2.3 单倍体酵母的配合及显色反应
• 6.2.4 阳性克隆质粒BglⅡ酶切鉴定分析结果
• 6.2.5 测序与同源性分析
• 6.2.6 回交试验结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 HCV p7 下调基因 p7TP2 的亚细胞定位研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 细胞、质粒及主要试剂
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 p7TP2 基因的PCR 扩增与pEGFP-C1-p7TP2 载体的构建
• 7.2.2 GFP 荧光显微镜观察p7TP2 基因产物在不同细胞系的定位
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 HCV p7 蛋白下调基因 p7TP2 启动子序列的 克隆及转录活性的鉴定
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 质粒及主要试剂
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果
• 8.2.1 CpG 岛分析
• 8.2.2 p7TP2 基因启动子活性区域的在线预测
• 8.2.3 启动子序列的确定及克隆化
• 8.2.4 荧光素酶报告基因表达载体及CAT 报告基因载体的构建
• 8.2.5 重组质粒转染细胞及报告基因CAT 的检测
• 8.2.6 利用不同的细胞系转染PGLB-p7TP2-p 质粒，双荧光素酶检测启动子活性
• 8.2.7 共转染试验验证HCVp7 蛋白对p7TP2 启动子活性的影响
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介