二苯乙烯苷对AD鼠内质网应激的影响及机制研究

二苯乙烯苷对AD鼠内质网应激的影响及机制研究

论文摘要

背景:老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer’s,AD)的主要组织病理变化,而β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)是老年斑的主要成分,因此,Aβ的神经毒性是AD形成和发展的关键因素。Aβ由39~43个氨基酸组成,来源于淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP),如果各种危险因素导致APP的异常剪切,Aβ的空间构象发生改变,就会导致Aβ异常聚集而产生神经毒性作用。正常情况下Aβ的空间二级结构以α螺旋为主,聚集性较弱,可被蛋白酶水解;如果Aβ构象发生错误折叠,转变为β折叠时,聚集性较弱,不易被蛋白酶水解,进而形成组织沉淀并诱导神经元凋亡。因此,在分子水平上,AD的疾病本质是一种神经变性构象病,一种蛋白错误折叠并聚集的“蛋白构象病”。钙稳态对细胞具有重要作用,细胞内钙的释放主要由位于内质网上的Ryanodine受体(RyRs)介导。当胞内钙超载时,会改变正常的内质网功能。内质网作为一个重要的亚细胞结构,除了钙的信号转导和钙储备的功能外,还具有蛋白质折叠和处理的功能。内质网蛋白折叠出现功能障碍,未折叠或错误折蛋白会在内质网沉积,导致内质网应激的产生,从而启动未折叠蛋白通路(unfolded protein response,UPR),一方面,上调内质网中分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulated protein,GRP78)的表达,纠正蛋白质错误的折叠构象;另一方面,通过上调内质网相关性的基因表达,降解或转移积累的错误折叠或未折叠蛋白质,以稳定内质网功能,保护细胞。但是目前研究发现,在神经变性构象病中,UPR非但不能进行细胞修复,相反还会启动细胞的凋亡通路,引起神经元的凋亡,其机制尚不清楚。现已知道,Aβ的神经毒性可引起神经元的内质网,线粒体,高尔基体等细胞亚结构发生肿胀变性,最终导致细胞的凋亡。有报道Aβ介导的细胞凋亡依赖Caspase12的参与,这提示可能是UPR启动了凋亡过程;Aβ的生成主要是在神经元的内质网,内质网对蛋白亚单位具有正确折叠或组装的功能,因此,我们推测在AD中,Aβ的神经毒性通过钙离子失衡使内质网结构损伤,蛋白质空间构象正常折叠的功能发生障碍,错误折叠Aβ在内质网腔内积聚,启动内质网应激,ATF6信号传导通路激活,分子伴侣GRPT8表达上调保护细胞;但应激过强时,保护机制不能与损伤抗衡,就会启动内质网特异性的Caspase12凋亡通路,引起神经元凋亡。对上述假设的研究在国内外鲜有报道。我们的实验将对以上推测进行验证,为进一步揭示AD的病理机理并提供新的研究思路。目前AD的治疗效果不甚理想,尚无十分有效方法与药物,我们对何首乌进行的相关研究表明,何首乌能改善AD模型大鼠学习记忆获得能力,但具体机理尚不清楚。因此在前期实验基础上,我们对何首乌的主要提取成分二苯乙烯苷(Tetrahydroxy Stilbene Glycoside,TSG)进行研究,通过以内质网应激为中心的UPR通路,GRP78和内质网凋亡途径进行研究,以进一步揭示何首乌治疗AD的主要作用机理及药物靶点。目的:探讨以内质网应激为中心的钙失衡和内质网反应性凋亡途径在AD发病中的作用及二苯乙烯苷的干预效果。方法:在立体定向仪下大鼠海马部位注射Aβ1-42造AD模型,大鼠随机分为对照组、模型组、二苯乙烯苷(TSG)组;用Y电迷宮实验检测大鼠记忆能力改变:电镜观察超微结构变化;免疫荧光法检测的胞内钙离子,在激光扫描共聚焦显微镜观察:免疫组化检测ERAB表达;RT-PCR法和Western法检测RyR3,GRP78和Caspase-12的表达;Tunel法检测细胞凋亡率的变化。结果:与对照组比较,模型大鼠躲避所需的电刺激次数增加;电镜观察到海马神经细胞胞浆水肿,线粒体肿胀,可见嵴断裂,内质网池扩张;内质网ERAB、GRP78、Caspase-12表达均增加,细胞凋亡率上升,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,二苯乙烯苷干预后,TSG组大鼠躲避所需的电刺激次数减少,记忆能力改善,超微结构病变显著减轻:胞内钙离子降低:RyR3mRNA表达无明显变化(P>0.05),ERAB,GRP78,Caspase-12表达下调,凋亡率下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.Aβ神经毒性作用引起的细胞内钙稳态失衡并非通过RyR3介导的钙释放(CICR)途径,而可能通过细胞膜通透性改变等所致。2.在AD中,内质网应激的启动可对细胞产生保护作用;但应激过强时,将通过内质网应激反应性凋亡途径诱导细胞死亡。3.何首乌提取物TSG通过纠正细胞内钙超载,降低内质网应激程度,抑制应激凋亡途径,来抵抗Aβ神经毒性损伤,改善学习记忆能力。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略
  • 前言
  • 第一章 AD模型鼠的建立及二苯乙烯苷对行为组织学的影响
  • 1.1 材料与方法
  • 1.2 结果
  • 1.3 讨论
  • 1.4 结论
  • 1.5 附图
  • 第二章 钙稳态失衡中钙离子和RyR3的表达变化及二苯乙烯苷的影响
  • 2.1 材料与方法
  • 2.2 结果
  • 2.3 讨论
  • 2.4 结论
  • 2.5 附图
  • 第三章 内质网应激中ERAB和GRP78的表达变化及二苯乙烯苷的影响
  • 3.1 材料与方法
  • 3.2 结果
  • 3.3 讨论
  • 3.4 结论
  • 3.5 附图
  • 第四章 内质网应激凋亡通路中凋亡率和Caspase-12的表达变化及二苯乙烯苷的影响
  • 4.1 材料与方法
  • 4.2 结果
  • 4.3 讨论
  • 4.4 结论
  • 4.5 附图
  • 参考文献
  • 综述
  • 1. 阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白与内质网应激的相关研究
  • 2. 内质网应激反应性凋亡途径的研究进展
  • 致谢
  • 攻读学位期间主要的研究成果
  • 相关论文文献

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