重组质粒载体和禽腺联病毒介导的miRNA抑制IBDV复制研究

论文摘要

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种鸡的高度接触性传染病,除引起鸡死亡和生产性能下降,还可导致感染鸡的免疫抑制和其它疫苗接种的免疫失败。IBD呈世界范围流行,尤其是近年来超强毒株和抗原变异株的出现,使得常规疫苗的免疫效果明显下降,给养鸡业造成的危害越来越大,迫切需要更为有效的新型防制措施。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近年来快速发展的一种转录后基因沉默技术,在功能基因组研究、肿瘤治疗和抗病毒感染等方面具有良好的应用前景,已被证明能抑制几乎所有种属病毒的复制。为探索用RNAi技术抑制IBDV复制的可行性,本研究在比较不同来源RNA聚合酶启动子转录活性基础上,选用禽源U6启动子构建短干扰RNA（short interference RNA,siRNA）表达载体,以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因为报告基因,证明在禽源细胞中能成功实现特异基因表达沉默;进而用专业软件预测IBDV VP2基因特异性siRNA,将人工合成的微小RNA（microRNA,miRNA）插入表达载体,以细胞转染法筛选出2个有效抑制IBDV VP2基因表达的miRNA,将其克隆入含neo基因的表达载体,经G418筛选获得抗性细胞克隆,用感染试验证明能显著抑制IBDV复制;最后将miRNA表达盒插入禽腺联病毒（avian adeno-associated virus,AAAV）转移载体,用重组病毒感染细胞进行的试验结果证明,表达的miRNA对IBDV复制不仅具有更为显著的抑制作用,而且对异源毒株复制也有类似的抑制效果,为IBD防制研究开辟了新的途径,现将试验结果总结如下。目前siRNA表达试验多用人或鼠源H1或U6启动子在哺乳动物细胞中进行,对于这些启动子能否在禽细胞中有效转录短发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）或miRNA仍有争议。我们利用siDirect软件预测GFP基因特异性siRNA,将人工合成的相应shRNA插入含人H1启动子的pSuper载体,获得重组载体pSuper-shRNA;再将shRNA表达盒插入含GFP基因的pEGFP-N1载体,获得重组载体pGFP-H1-shRNA。分别以pEGFP-N1、pSuper-shRNA+pEGFP-N1和pGFP-H1-shRNA转染哺乳动物源COS-1、293-T细胞和禽源鸡胚肝（CEL）、鸡胚成纤维（CEF）细胞,根据相同条件下转染细胞培养中荧光阳性细胞数及荧光强度的变化,比较人H1启动子在哺乳动物源和禽源细胞中转录shRNA的效率。结果显示,人H1启动子在哺乳动物细胞中能有效转录shRNA,但在禽源细胞中的转录效率很低。这些试验结果表明,开展禽源细胞siRNA表达研究应选用禽源启动子。为了开展禽源细胞RNAi研究,以含鸡U6启动子的pRFPRNAiC为miRNA表达载体,用Genscript软件预测GFP序列特异性siRNA,从10个潜在的siRNA中随机选择1个siRNA序列,用PCR合成双链寡核苷酸,将其插入表达载体pRFPRNAiC,用获得的重组载体pRFPRNAiGFP与报告质粒pEGFP-N1共转染COS-1、293-T、CEL和CEF细胞,根据相同条件下GFP阳性细胞数及荧光强度变化,比较哺乳动物和禽细胞中鸡U6启动子表达miRNA的效率。结果显示,pRFPRNAiGFP在哺乳动物和禽源细胞中都能表达抑制性miRNA,在禽源细胞中转录效率较高。这些试验结果表明,源禽U6启动子转录miRNA的细胞种属特异性相对较弱,pRFPRNAiC载体可用于禽源细胞的miRNA表达研究。为了探索用RNAi技术抑制IBDV复制的可行性,利用Genscript软件预测针对IBDV VP2基因的siRNA,从10个潜在的siRNA中选择5个siRNA序列,将PCR产生的双链寡核苷酸插入pRFPRNAiC载体,获得重组载体pRFPRNAmiVP2A、pRFPRNAmiVP2B、pRFPRNAmiVP2C、pRFPRNAmiVP2D、pRFPRNAmiVP2E;根据IBDV Lukert株VP2基因序列设计引物,用PCR扩增不含自身翻译终止码的VP2基因,将扩增产物与pEGFP-N1载体中GFP基因的N端融合,获得报告载体pVP2-GFP。分别将5个miRNA表达载体与报告载体共转染DF-1细胞,在转染后24h用Northern Dot Blotting确认miRNA表达,然后分别用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术对转染细胞培养中的荧光阳性细胞数及荧光总量进行定性和定量分析。结果与报告载体单独转染细胞相比,5个miRNA表达载体与报告载体共转染细胞的荧光抑制效率在59.7%-78.5%之间;将抑制效果较好的miVP2A和miVP2E表达盒分别克隆入含neo基因的pTarget载体,用获得的重组载体转染DF-1细胞,经G418筛选后获得抗性细胞,用IBDV Lurket感染,感染三天后用半定量RT-PCR测定VP2基因表达,并测定IBDV半数组织细胞感染剂量(TCID50)。结果显示,miVP2A和miVP2E表达细胞中VP2基因表达抑制率分别为80.7%和75.0%,TCID50分别下降6和5lgs。这些试验结果表明,针对VP2基因的两个miRNA对IBDV基因表达和复制均有显著的抑制作用。利用重组AAAV稳定表达外源基因的特点,用限制酶消化法去除含AAAV全基因组质粒载体pCR-AAAV中的Pep和Cap蛋白编码序列,获得AAAV转移载体pAITR;分别将miVP2E和针对VP1基因的miVP1表达盒连同红色荧光蛋白（redfluorescent protein,RFP）基因表达盒插入pAITR中左、右ITR之间,分别用获得的重组载体pAITR-RFP-miVP2E和pAITR-RFP-miVP1与AAAV包装载体pcDNA-ARC及腺病毒辅助载体pHelper共转染AAV-293细胞,经PCR检测证明获得的rAAAV中含有miRNA表达盒,纯化rAAAV感染性滴度为8×108TU/ml;用rAAAV转导DF-1细胞,转导后48h用3株IBDV感染,感染后不同时间用TCID50测定法检测感染性病毒,用半定量RT-PCR检测病毒基因表达,。结果显示,在IBDV Lukert株感染后96h,miVP2E和miVP1表达细胞中VP2基因表达抑制率分别为85.2%和89.6%,TCID50分别下降6和7lgs;用另两株IBDV感染miVP2E和miVP1表达细胞,感染性病毒测定结果显示,miVP2E表达细胞中2株IBDV的TCID50分别下降7lgs（YEZ株）和2.5lgs（LYG株）,miVP1表达细胞中2株IBDV的TCID50分别下降7lgs（YEZ株）和6.5lgs（LYG株）,基因表达和病毒复制抑制作用至少维持6天。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 部分缩写的中英文对照
• 综述一:鸡传染性法氏囊病病毒研究进展
• 参考文献
• 综述二:RNA干扰研究进展
• 参考文献
• 研究内容一:人H1启动子转录shRNA的细胞种属特异性
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 研究内容二:禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 研究内容三:禽源细胞中miRNA表达方法建立及基因沉默效果验证
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 研究内容四:重组质粒表达的VP2基因特异miRNA对IBDV复制的抑制作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 研究内容五:重组AAAV表达的miRNA对IBDV复制的抑制作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文