论文摘要
由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是一种在世界范围内普遍流行的气传性病害,严重威胁小麦生产。选育并合理利用抗病品种是防治麦类锈病危害最经济、安全、有效的途径之一。因此,利用和发掘抗叶锈资源,延长品种的抗叶锈性寿命,成为小麦叶锈病防治的一项任务。本研究选择当前在我国抗性较好的小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24为研究对象,应用同源序列法和cDNA-AFLP技术对其进行抗病相关基因的研究,利用荧光实时定量PCR进行表达分析,同时利用BSMV VIGS技术对基因进行了初步的功能验证。主要结果如下:1根据已克隆植物抗病基因NBS保守结构域设计引物,从携带小麦抗叶锈病基因Lr24的回交6代近等基因系材料TcLr24中获得了1个通读的小麦抗病基因同源片段RGA1。该片段含有NB-ARC保守结构域,具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2、激酶3a等）。2以获得的RGA1片段为靶序列,利用RACE技术获得了2822bp的TcLr24 cDNA全长RGA1。RGA1包含2397bp的开放阅读框,编码799个蛋白质氨基酸序列,RGA1编码产物具有NBS、LRR等抗病基因保守结构域,与多个已知植物抗病基因的功能相应区域一致。Southern杂交结果表明,其在TcLr24基因组中为单拷贝。实时荧光定量PCR对RGA1基因的表达情况研究表明,该基因为组成型表达。BSMV VIGS功能验证没有发生表型改变。3本研究利用cDNA-AFLP技术筛选了84对引物能够在小麦近等基因系TcLr24和感病对照Thatcher之间揭示出多态性,根据基因表达与否以及表达量,获得了9种不同差异表达的多态性条带类型,分别代表了不同状态下测试材料的表达状况。4成功克隆和测序了121个差异表达片段（Transcript-derived fragments,TDFs）,测序结果在NCBI上应用BLASTx比对进行推导的蛋白质序列的相似性分析,结果共有32条为功能已知的同源序列,占总数的27%;比对上功能未知的序列37条占总数的30%;没有比对上的序列45条占总数的37%。已知功能序列的TDFs涉及初级代谢、转运相关、抗病与防御、转录相关、信号传导相关、细胞结构、能量代谢、蛋白储运等。5从差异表达并测序的片段中选取了9个进行荧光实时定量PCR分析,证实了这些基因差异表达是由于叶锈菌诱导表达的结果,发生在小麦与叶锈菌互作的早期。与cDNA-AFLP表达基本一致,说明利用cDNA-AFLP分析基因的表达是可靠的。6利用RACE的方法获得了3个激酶基因,包括TaSTK （1475bp）,TaRLPK （2398 bp）,TaLRRK （2038 bp）,分别编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（408aa）,类受体激酶（656aa）,LRR-受体激酶（595aa）。InterProScan分析表明,它们所编码的蛋白都具有典型的蛋白激酶的核心区域,属于激酶类基因,并且这三个蛋白的磷酸化作用需要依赖ATP。经Psort预测显示,TaSTK编码的蛋白最可能分布在叶绿体基质中,几率为85.4%,而TaRLPK和TaLRRK编码的蛋白分布在质膜中的可能性较大,几率分别为51.4%和46%,表明TaRLPK和TaLRRK编码的蛋白是膜蛋白。氨基酸比对及进化树分析表明,TaSTK,TaRLPK,TaLRRK分别与大麦、水稻、小麦等激酶具有较高的相似性。7利用BSMV VIGS基因沉默技术对3个激酶基因进行了初步的功能分析。结果表明3个基因被沉默后发生了不同程度的表型变化,并且组织学观察的结果与其表型变化一致。其中,TaSTK基因被沉默的小麦叶片接种叶锈菌后表型由“;”转变成“1”,组织学中观察到,接种叶锈菌120hpi,寄主细胞坏死,但菌丝仍然扩展明显。而TaRLPK和TaLRRK基因被沉默的小麦叶片在接种叶锈菌后表型由“;”转变成“2”,表现为中抗反应。120hpi组织学观察发现,叶锈菌侵染后形成少量坏死,但是这些坏死不能完全抑制病原菌的生长,表现出对叶锈菌的中度抗性反应。研究表明这三个激酶基因参与了小麦抗叶锈性。
论文目录
相关论文文献
- [1].TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析[J]. 西北农业学报 2016(04)
- [2].TcLr24小麦STK类抗病基因同源片段的分离和特征分析[J]. 华北农学报 2010(05)
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