水稻骨干亲本不同发育时期蛋白质表达的多态性研究

论文摘要

背景:水稻种质资源是水稻育种研究的物质基础,正确合理的选用优良资源,是提高育种成效的关键技术之一。全世界的稻种资源约10万余份,截止2003年,我国共编目稻种资源7万多份,但是已被有效利用的骨干品种并不多,主要集中在极少数品种的衍生系统当中。在系统演进过程中,随着新基因的不断加入,骨干品种的遗传背景也得到不断丰富,从而为杂交育种提供了良好的选择材料。一个优良的亲本材料,除了具有丰富优良的遗传特性外,还要具有将这种性状传递给后代的能力。所以在育种上应该了解其亲本性状及性状基因组成,选择与其生态类型、亲缘关系存在一定差异,地理上距离较远的亲本,使其可以弥补骨干亲本的缺点,促成优良性状的相互结合,以利于基因的重组,从而取得较高的成果。随着现代生物技术尤其是基因组学技术的发展,人们对水稻亲本的了解从传统的形态和农艺性状正在向基因组、转录组和蛋白质组学方向深入。本实验对9个蛋白质在多个水稻骨干亲本不同发育时期中的表达进行了调查,获得了蛋白质表达多态性的证据,为进一步的亲本选择和功能研究提供数据资源。研究目的:骨干亲本是育种的重要基础,对骨干亲本重要蛋白质在不同亲本不同生长发育时期表达特征的研究有助于了解其形成机理并促进其应用,为其功能研究奠定基础。材料与方法:选取9个水稻基因,GST和BBTI8用表达的全长蛋白质制备抗原,Myb是经过预测的片段蛋白质的表达制备的抗原,蛋白质的表达量和纯度均可以满足制备抗体的要求。将上述蛋白质免疫动物制备多克隆抗体,利用重组蛋白质抗原检测验证抗体的特异性,其余6个蛋白质特异的抗体为实验室前期制备的[31]。本研究用Western blotting技术调查了6个水稻骨干亲本（9311、培矮64s、特青、珍汕97B、广陆矮4号和矮脚南特）在不同生长发育时期/部位（苗期地上部与地下部、开花期剑叶和穗子、成熟期剑叶和穗子）与光合作用、活性氧清除及胁迫防御相关的9个蛋白质的表达,发现了这些蛋白质在不同亲本之间以及不同时期部位的表达多态性,为下一步相关的功能研究等提供了重要参考数据。结果:GST、Myb和BBTI8在体外克隆表达后获得了高纯度的蛋白质,获得了特异性的抗体,Western blotting结果揭示大部分蛋白质在水稻叶片中表达量较高且比较稳定,亲本间变化不大,而在OEEⅠ、GAPDH、SBPase、FBPA、GST、Myb和BBTI8的苗期地下部、开花期穗子和成熟期种子中的表达模式变化较大,不同亲本间呈现较高的多态性,包括条带的有无、强度的增减或新条带的出现,这些蛋白质表达的多态性反应了不同亲本的特点,可以作为品种鉴别的一种新的标记,此外,蛋白质表达在不同发育时期/部位间也有多态性和组织特异性,反映了蛋白质表达的时空特异性。在此基础上,有可能逐步建立起基于蛋白质表达特征的免疫学检测体系,用于品种的鉴别及田间的筛选。结论:本研究中制备了多个重要的水稻蛋白质特异的抗体,通过Western blotting技术鉴定了这些蛋白质表达在不同亲本间的多态性,尤其在地下部、穗、种子等部位的表达差异较大,而在叶片中的表达比较接近。此外,蛋白质表达在不同发育时期/部位间也有多态性,反映了蛋白质表达的时空特异性,显然这些抗体可以用于相关蛋白质的功能研究中。本研究初步建立一条利用蛋白质特异抗体了解水稻蛋白质表达的研究途径,可对特定蛋白质的多态性进行分析。所制备抗体为相关功能的研究,如免疫共沉淀、Chip-on-chip、Pull-down以及抗逆反应等积累了资源,同时,也可以借助这条路线系统了解特定的基因家族和特定代谢途径中的蛋白质表达情况进行分析研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 水稻育种研究的概况
• 1.2 水稻骨干亲本及其育种价值
• 1.3 水稻重要农艺性状与相关蛋白质研究进展
• 1.4 研究展望
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 水稻骨干亲本材料
• 2.2.1 骨干亲本的选择
• 2.2.2 水稻种植
• 2.2.3 水稻取材
• 2.3 目的基因的克隆
• 2.3.1 抗原决定簇预测及扩增
• 2.3.2 PCR 产物纯化
• 2.3.3 PCR 产物和载体酶切
• 2.3.4 重组载体构建
• 2.3.5 细菌感受态制备
• 2.3.6 热激法转化
• 2.3.7 质粒DNA 的提取及酶切
• 2.4 蛋白质的诱导表达及 SDS-PAGE 检测
• 2.5 融合蛋白质表达纯化及抗体制备
• 2.5.1 融合蛋白质的大量表达
• 2.5.2 融合蛋白质的纯化及抗体制备
• 2.6 水稻组织全蛋白质提取
• 2.7 Western blotting 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因的选择
• 3.2 目标DNA 片段的扩增
• 3.3 重组质粒的构建
• 3.4 蛋白质表达、纯化及抗体制备
• 3.5 抗体的特异性检测
• 3.6 光合作用相关蛋白质的表达及多态性分析
• 3.7 活性氧清除相关蛋白质的表达及多态性分析
• 3.8 胁迫防御相关蛋白质的表达及多态性分析
• 4 讨论
• 4.1 抗原制备方法的选择
• 4.2 目标蛋白质的选择
• 4.2.1 光合作用相关蛋白质及其表达谱多态性分析
• 4.2.2 活性氧清除相关蛋白质及其表达谱多态性分析
• 4.2.3 胁迫防御相关蛋白质及其表达谱多态性分析
• 4.3 骨干亲本蛋白质的研究意义
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 叶片蛋白提取液配制
• 细菌培养基制备
• Westem blotting 所用溶液的配制
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢