镉超积累植物东南景天谷胱甘肽代谢特征及比较蛋白质组学研究

论文摘要

镉（Cd）是生物毒性最强的重金属元素之一，其迁移性很强，且极易被植物吸收并积累，通过食物链富集对人体产生慢性中毒，因此镉污染对生态环境、食品安全和农业可持续发展构成严重的威胁。植物提取修复是一种利用植物对重金属等污染物的超积累能力清除污染物的环境治理技术，该技术的应用前景关键在于揭示植物对重金属的超积累机制。东南景天（Sedum alfredii Hance）是在我国东南部地区一些古老的铅锌矿上发现的一种新的镉超积累植物。本论文以超积累生态型（hyperaccumulating ecotype，HE）东南景天和非超积累生态型（non-hyperaccumulating ecotype，NHE）东南景天为材料，采用营养液培养方法，运用透射电镜、组织化学、生化分析、蛋白质双向电泳分离和生物质谱分析和生物信息学等方法技术，研究了镉胁迫下东南景天的生理响应及比较蛋白质组学．取得的主要研究结果如下：1．超积累生态型东南景天对镉具有异常耐性和超积累能力。当镉处理浓度高于10μM时，非超积累生态型东南景天严重受害，生长受抑制，根长、根表面积、根系直径、根系体积和根系活力都显著地降低，地上部和根部生物量（干重）相比对照显著降低（达31．2％～46．8％）。超积累生态型东南景天在100μM镉处理7天条件下，地上部镉含量和积累量分别达到4246 mg kg-1DW和370μgplant-1。高浓度镉胁迫下对超积累生态型根系生长抑制不明显，同时其良好的根系形态与活力的维持有助于其对镉吸收及从根系转运至地上部。2．通过透射电镜观察发现，高浓度的镉胁迫对东南景天根分生细胞的毒害症状主要表现在细胞壁增厚、细胞空泡化、质壁分离、质膜和根表皮破坏，并受到细菌侵染，但镉对超积累生态型毒害相比非超积累生态型要小的多。超微结构研究表明，镉胁迫对东南景天叶肉细胞器影响最严重的是叶绿体和线粒体。镉胁迫导致东南景天尤其是非超积累生态型细胞器中的叶绿体、线粒体肿胀，严重的则出现叶绿体扭曲变形的情况。高浓度的镉使东南景天细胞质组分流失，叶绿体基质类囊体肿胀和结构松散，嗜锇颗粒明显地增多并变大，说明在逆境的条件下，叶绿体片层合成受阻，光合作用平衡被打破，出现衰老迹象，进而使得植物叶片老化。3．两种生态型东南景天体内膜质过氧化水平及H2O2和O2·-含量随着外界镉处理浓度的增加而提高，镉毒害作用导致了东南景天体内处于氧化胁迫，但超积累生态型东南景天比非超积累生态型具有更强的镉胁迫适应能力。原位显影法研究证实镉胁迫导致东南景天体内活性氧自由基（H2O2和O2·-）过量积累，NADPH氧化酶主动地参与了两种生态型东南景天的生理过程。BSO（谷胱甘肽合成抑制剂）的渗透处理使超积累生态型东南景天叶片受害加据，H2O2和O2·-积累分别增加了31％和13％，但BSO渗透处理对非超积累生态型东南景天叶片活性氧自由基影响不显著，表明超积累生态型东南景天体内谷胱甘肽可能参与对镉诱导产生的活性氧自由基代谢的调控。4．在低浓度镉（≤μM）胁迫下非超积累生态型东南景天体内SOD、G-POD及APX等抗氧化保护酶的活性增强，但更高浓度镉则明显的抑制了其抗氧化系统活性。然而，超积累生态型东南景天体内抗氧化酶如CAT、G-POD、APX及GR则是在镉处理浓度≤100μM时失活，而后在更高浓度的镉刺激下则增强，推测高浓度镉导致H2O2的积累进而启动了抗氧化系统的二次防御作用。镉处理24h后，两种生态型东南景天根系和叶片中抗坏血酸（AsA）含量显著升高，且两种生态型东南景天叶片中的DHA（脱氢抗坏血酸）／AsA比率在镉处理条件下一直维持在<1的状态即趋于还原态。研究结果表明两种生态型东南景天体内抗氧化物酶和抗坏血酸对镉胁迫均有明显响应，但二者不是造成两种生态型对镉的积累和耐性能力差异的主要原因。超积累生态型东南景天根系和叶片中谷胱甘肽（GSH）含量显著地高于非超积累生态型，且超积累生态型东南景天体内GSH含量随着镉处理浓度的加大和处理时间的延长而显著提高，但镉胁迫对非超积累生态型体内GSH含量影响不显著，这表明GSH可能在超积累生态型东南景天对镉的耐性和超积累性状方面发挥至关重要的作用。5．为了探讨GSH对东南景天镉胁迫耐性的影响，我们通过用谷胱甘肽合成抑制剂（BSO）预处理来降低植物体内的GSH含量。超积累生态型东南景天在BSO和Cd复合处理24 h或更长时间后，其叶片中H2O2含量相比单独Cd处理要高得多，这与叶片内活性氧自由基原位显影结果一致，表明谷胱甘肽合成对镉诱导产生的活性氧自由基有积极的抵抗作用，从而有助于增强植物对镉毒害效应的抵御能力。此外，超积累生态型（HE）东南景天在BSO和Cd复合处理24 h后，其根系中H2O2含量相比单独Cd处理要高24％。与只有Cd处理相比，超积累生态型东南景天根系和叶片中GSH含量在BSO和Cd复合处理8天后根系和叶片中GSH含量降低了40％，同时，BSO和Cd复合处理使超积累生态型东南景天根系和叶片中镉浓度分别降低了41％和36％。这些结果表明，GSH合成代谢在超积累生态型东南景天对镉耐性和吸收调控中起到信号传导作用，一方面作为抗氧化剂参与活性氧代谢，另一方面通过螯合Cd2+参与超积累生态型东南景天体内镉解毒过程。6．通过比较多种蛋白提取方法，发现通过苯酚抽提-TCA／丙酮沉淀法相结合制备东南景天叶和根组织总蛋白比较适合双向电泳（2-DE）分析。通过该方法，能有效地去除干扰物质及样品中的盐离子，有利于等电聚焦，使电压能很快上升到设定高压值；此外，还可以降低次生代谢物质的干扰、减少蛋白降解，起到浓缩蛋白的作用。7．利用双向电泳技术研究了东南景天不同生态型蛋白质组差异及镉胁迫下的蛋白质表达，并通过MALDI-TOF-MS及ESI-MS初步鉴定了49个蛋白质可能与镉耐性或积累相关。这些蛋白质包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基、ABC转运子家族、成熟酶、根边缘细胞特异蛋白、肌动蛋白、激素反应蛋白家族、延伸因子1α、组蛋白H2A、含CheY类似受体和Fis型HTH两个结构域的反应调节蛋白、天冬氨酰蛋白酶家族、转导家族蛋白、色氨酸合成相关蛋白、氨基酸转运子、富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶、α-葡聚糖水合二激酶、脂类相关家族蛋白、DNA结合／DNA相关RNA聚合酶、WD-40重组蛋白、SKIP1相互作用成分1、orf409、Prp9、Os02g0439200和功能未明的假设蛋白等。这些蛋白功能涉及蛋白合成、信号转到、转录、初级代谢、光合作用、细胞结构、转运子、蛋白储存等。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 主要缩略词表
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 土壤镉污染及镉对植物的毒害
• 1.1 土壤镉污染危及农产品安全生产
• 1.2 镉胁迫对植物新陈代谢和生理生化的影响
• 1.2.1 镉胁迫对植物生长的影响
• 1.2.2 镉胁迫对植物叶绿体结构和光合系统的影响
• 1.2.3 镉胁迫对植物体内活性氧自由基及抗氧化保护系统的影响
• 2 植物耐受或积累重金属的分子遗传机制研究进展
• 2.1 植物超积累重金属的分子及细胞学机制
• 2.1.1 金属转运子
• 2.1.2 氨基酸和有机酸
• 2.1.3 植物螯合素
• 2.1.4 金属硫蛋白
• 2.1.5 热激蛋白
• 2.1.6 其他金属结合蛋白
• 2.2 用于植物修复的植物的遗传基因工程
• 2.2.1 植物体内重金属抗性相关基因的分离
• 2.2.2 植物螯合素合成酶基因的分离
• 2.3 金属超积累的遗传基础
• 2.4 展望
• 3 蛋白质组学及其在植物营养学研究中的应用
• 3.1 应用于蛋白质组学研究的生物技术
• 3.1.1 双向凝胶电泳
• 3.1.2 质谱技术
• 3.1.3 酵母双杂交系统
• 3.1.4 蛋白质组生物信息学
• 3.2 蛋白质组学在植物营养学研究中的应用
• 3.2.1 养分和环境胁迫下植物的蛋白质组学
• 3.2.2 植物激素的蛋白质组学
• 3.3 展望
• 4 本研究意义及内容
• 4.1 研究意义
• 4.2 研究内容
• 第二章 镉胁迫下东南景天生长及细胞结构变化
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 植物培养（营养液培养）
• 2.1.3 植物镉试验处理设计
• 2.1.4 植物体内镉浓度含量测定
• 2.1.5 植物根系形态和根系活力测定
• 2.1.6 透射电镜
• 2.1.7 数据处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 镉胁迫对东南景天生物量及体内镉含量的影响
• 2.2.2 镉胁迫对东南景天根系形态和根系活力的影响
• 2.2.3 镉胁迫对东南景天根分生细胞超微结构的影响
• 2.2.4 镉胁迫对东南景天叶肉细胞超微结构的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 镉对东南景天体内活性氧自由基产生及抗氧化系统的影响
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 植物培养（营养液培养）
• 3.1.3 植物镉试验处理设计
• 3.1.4 植物样品制备
• 3.1.5 叶片中过氧化氢和超氧阴高子原位分析
• 3.1.6 过氧化氢和丙二醛含量测定
• 3.1.7 抗氧化酶活性测定
• 3.1.8 谷胱甘肽和抗坏血酸含量测定
• 3.1.9 数据处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 镉对东南景天体内膜质过氧化和过氧化氢含量的影响
• 3.2.2 镉处理下东南景天叶片活性氧自由基调控
• 3.2.3 镉胁迫下东南景天体内抗氧化酶的响应
• 3.2.4 镉胁迫对东南景天体内抗氧化物含量的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 谷胱甘肽合成对东南景天适应镉胁迫的影响
• 引言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 植物培养（营养液培养）
• 4.1.3 植物镉试验处理设计
• 4.1.4 植物体内镉浓度含量测定
• 4.1.5 过氧化氢和丙二醛含量测定
• 4.1.6 抗氧化酶活性测定
• 4.1.7 谷胱甘肽、抗坏血酸和脱氢抗坏血酸含量测定
• 4.1.8 数据处理
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 BSO处理对东南景天生长和体内镉积累的影响
• 4.2.2 BSO处理对东南景天体内过氧化氢积累的影响
• 4.2.3 镉处理不同时间对东南景天体内抗氧化物酶活性的影响
• 4.2.4 镉处理不同时间对东南景天体内抗坏血酸和脱氢抗坏血酸含量的影响
• 4.2.5 BSO处理对东南景天体内谷胱甘肽含量的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 东南景天组织蛋白组样品制备方法优化
• 引言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料及处理
• 5.1.2 东南景天叶片蛋白提取
• 5.1.3 东南景天根蛋白提取
• 5.1.4 蛋白溶解及定量
• 5.1.5 双向电泳
• 5.1.6 染色
• 5.1.7 图象的扫描和分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 东南景天叶蛋白提取2-DE图谱比较分析
• 5.2.2 东南景天根蛋白提取2-DE图谱比较分析
• 5.3 讨论
• 第六章 东南景天不同生态型蛋白质组差异及镉胁迫下的蛋白质表达
• 引言
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 植物培养
• 6.1.3 植物镉试验处理设计
• 6.1.4 叶和根总蛋白提取
• 6.1.5 蛋白质裂解
• 6.1.6 固相pH梯度双向凝胶电泳
• 6.1.7 银染
• 6.1.8 图像采集
• 6.1.9 胶内酶解
• 6.1.10 质谱鉴定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 东南景天双向电泳（2-DE）方法的建立
• 6.2.2 超积累生态型和非超积累生态型东南景天蛋白质表达差异的分析
• 6.2.3 镉胁迫下非超积累生态型东南景天蛋白质表达差异的分析
• 6.2.4 镉胁迫下超积累生态型东南景天蛋白质表达差异的分析
• 6.2.5 MALDI-TOF MS鉴定差异表达的蛋白
• 6.2.6 ESI-MS鉴定差异表达的蛋白
• 6.2.7 蛋白质功能分析
• 6.3 讨论
• 第七章 主要研究结果、创新点与研究展望
• 7.1 主要研究结果
• 7.1.1 镉胁迫对东南景天生长及亚细胞结构的影响
• 7.1.2 镉胁迫下东南景天体内活性氧产生及调控
• 7.1.3 东南景天体内抗氧化系统和谷胱甘肽代谢对镉胁迫的响应
• 7.1.4 东南景天组织蛋白组样品制备方法和双向电泳条件的优化
• 7.1.5 镉胁迫下东南景天蛋白质组表达差异分析
• 7.2 综合讨论
• 7.2.1 东南景天谷胱甘肽代谢与镉胁迫
• 7.2.2 东南景天蛋白质组学研究
• 7.3 主要创新点
• 7.4 研究展望
• 参考文献
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果