福氏志贺氏菌耐药相关基因的克隆、表达及蛋白纯化与结晶的初步研究

论文摘要

在细菌耐药研究中有关细菌主动外排泵的研究是相对活跃的领域。外排泵是微生物对药物和其他外来物质产生耐药性的一个重要机制,其中acrAB-tolC是一种常见的外输泵,是由药物外输蛋白AcrA、AcrB和调节蛋白MarA调控作用来完成的。本研究对福氏志贺菌多药耐药相关基因marA、acrA和acrB的克隆、蛋白表达、纯化及结晶进行研究。根据已有数据,设计marA、acrA和acrB基因引物,提取基因组DNA并通过PCR扩增目的基因,构建克隆载体后,分别将目的基因片段通过BamHⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。经酶切鉴定及序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中,其核苷酸序列与报道的marA和acrA基因的同源性为100%,acrB基因同源性为99.7%。重组表达质粒转化BL21（DE3）pLys, 37℃诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测表明,marA和acrA基因成功地在大肠埃希氏菌中得到了表达,表达蛋白的大小分别约为21kDa和45kDa。通过可溶性分析得知acrA为可溶性表达蛋白,marA以包涵体形式表达。利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对marA蛋白进行复性。用金属鳌合亲合层析的方法对表达的marA和acrA蛋白进行纯化和浓缩纯化蛋白,测定表达蛋白的浓度为5 mg/mL,试验获得了能够结晶的高浓度蛋白。采用悬吊液滴蒸汽扩散法,对蛋白结晶条件进行筛选。观察发现,在多种结晶条件下出现了晶体,分别观察到八面体、菱形、针状等多种规则形态。本研究为福氏志贺菌耐药基因蛋白的高级结构,MarA,AcrA和AcrB的结合方式及探索MarA,AcrA和AcrB蛋白的其他功能奠定基础,同时为进一步研究福氏志贺菌耐药基因的作用机制提供依据。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 第一章 引言
• 1.1 志贺菌及其耐药性
• 1.2 大肠杆菌多药外输泵 AcrAB-TolC 的研究进展
• 1.3 蛋白质分离纯化
• 1.4 蛋白结晶
• 1.5 本研究的意义、内容及技术路线
• 第二章 福氏志贺菌多药外输基因MARA、ACRA 和ACRB 的克隆与序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 福氏志贺菌基因组DNA 的提取
• 2.2.2 目的片段的扩增与回收
• 2.2.3 目的基因的克隆
• 2.2.4 重组质粒的提取与鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 PCR 产物的电泳结果
• 2.3.2 重组质粒pMD18-T-marA、pMD18-T-acrA 和pMD18-T-acrB 的PCR 和酶切鉴定
• 2.3.3 marA、acrA 和acrB 同源性分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 福氏志贺菌MARA、ACRA 和ACRB 基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 重组质粒、宿主菌株
• 3.1.2 试剂、工具酶及试剂盒
• 3.1.3 仪器与设备
• 3.1.4 主要试剂的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 目的片段的扩增
• 3.2.3 目的片段与pET-30a 载体的酶切回收
• 3.2.4 目的片段与载体的连接转化
• 3.2.5 重组质粒pET-marA、pET-acrA 和pET-acrB 的提取与鉴定
• 3.2.6 重组质粒pET-marA、pET-acrA 和pET-acrB 的重新转化
• 3.2.7 重组质粒pET-marA、pET-acrA 和pET-acrB 的诱导表达
• 3.2.8 表达产物的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组表达载体的构建和鉴定
• 3.3.2 表达产物的检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 氨基酸序列分析
• 3.4.2 pET 融合表达载体的选择
• 3.4.3 诱导表达
• 3.5 小结
• 第四章 重组蛋白纯化和结晶的初步研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 重组表达菌
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 pET-acrA 和pET-marA 表达菌的诱导表达
• 4.2.2 表达产物的可溶性分析
• 4.2.3 包涵体的洗涤与溶解
• 4.2.4 MarA 蛋白变性液的复性
• 4.2.5 acrA 和marA 的纯化及浓缩
• 4.2.6 蛋白结晶条件的筛选
• 4.3 结果
• 4.3.1 可溶性分析
• 4.3.2 包涵体的变性与复性
• 4.3.3 蛋白纯化
• 4.3.4 蛋白结晶
• 4.4 讨论
• 4.4.1 包涵体的变性、复性
• 4.4.2 蛋白纯化
• 4.4.3 蛋白质溶液的浓缩方法
• 4.4.4 蛋白结晶
• 4.5 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介