HBV去甘露聚糖修饰逃逸树突状细胞DC-SIGN免疫识别的研究

论文摘要

目的：研究HBV感染是否会引起宿主细胞Golgi M I活性升高,通过抑制Golgi M I介导的HBV去甘露聚糖修饰,观察对DC-SIGN识别及DC成熟和功能的影响,来阐明DC-SIGN在HBV感染中介导的作用,并初步探讨HBV通过去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN的识别,限制DC的活化的机制。方法：一.研究HBV感染是否会引起宿主细胞Golgi M I活性升高1.培养HepG2细胞和HepG2.2.15细胞,采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化高尔基复合体；2.比色法检测两种细胞高尔基复合体中Golgi M I的活性；3. RT-PCR法检测基因MAN1A1、MAN1A2和MANIC1 mRNA的表达；4. Western blot检测上述3种基因编码的蛋白的表达情况。二. DC-SIGN在识别HBV并活化DC中介导作用的研究1.将不同终浓度的Golgi M I抑制剂——基夫碱加到HepG2.2.15细胞的培养基中,作用24小时后分离高尔基体,比色法检测Golgi M I的活性；2.在HepG2.2.15细胞的培养基中加入终浓度为5ug/ml的基夫碱,持续处理5天后收集其培养上清液,提取得到高甘露糖型HBV颗粒,采用荧光定量PCR的方法检测HBV DNA滴度；3.分离健康人外周血单个核细胞,在体外GM.CSF和IL-4的作用下诱导分化成DC,光学显微镜和透射电镜观察细胞的形态特征；4.将前面得到的高甘露糖型HBV颗粒（5×106copies/ml）,加入到培养至第5天的DC的培养基中,培养至第7天时,采用透射电镜观察细胞的形态结构,流式细胞仪检测DC表面CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子的表达,MTT法检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力,ELISA法检测DC上清液中IL-12的水平。同时设加PBS组和加未经基夫碱处理的HepG2.2.15细胞分泌的HBV组作为对照。5.将培养至第5天的DC预先经DC-SIGN特异性抗体阻断2小时,而后再分别加入PBS和上述两种类型的HBV干预,检测指标同前。三.HBV去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN免疫识别的机制初探1.采用分子克隆的方法构建HBVS、LS、MS、HBe、HBc、HBx 6个功能蛋白的真核表达载体,采用酶切及DNA测序的方法鉴定重组质粒；2.再将以上构建的6个质粒和pEGFP-N 1质粒分别经Lipofectamine2000转染入HepG2细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,计算转染效率,比色法检测细胞高尔基体内Golgi M I的活性；3.分别将pEGFP-N1-HBe质粒和pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞,RT-PCR检测转染细胞Golgi M I 3种亚型的基因MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1 mRNA的表达情况,Western blot检测相应的蛋白表达。结果：一.研究HBV感染是否会引起宿主细胞Golgi M I活性升高与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞Golgi M I的活性明显升高,MAN1A1、MAN1A2的mRNA水平显著上调,所编码的MAN1A1.MAN1A2蛋白量也显著增加,而MAN1C1的mRNA和蛋白的表达量无明显变化。二.DC-SIGN在识别HBV并活化DC中介导作用的研究1.基夫碱在HepG2.2.15细胞中可发挥对GolgiM I的抑制作用,5ug/ml是合适的干预浓度；2.基夫碱干预的HepG2.2.15细胞与未经基夫碱干预的HepG2.2.15细胞分泌的HBV载量无显著差异；3.电镜观察培养第7天的经TNF-α刺激的DC,细胞体积变大,突起明显增多,向四周伸展出大量的毛刺样细胞质突起,长短不一,呈现典型成熟DC的形态；4.与HBV组相比,基夫碱+HBV组的DC表面CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子的表达增加,分泌IL-12的水平升高,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力亦明显增强；5.预先加入DC-SIGN特异性抗体进行阻断的DC,在经高甘露糖型HBV干预后,与未经抗体阻断组的DC相比,DC表达CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子的量下降,分泌IL-12的量减少,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力亦有所减弱。三.HBV去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN免疫识别的机制初探1.构建的6个质粒酶切及测序的结果均与预计结果一致；2.转染各个质粒的细胞在荧光显微镜下都可见到绿色荧光的表达；3.与转染pEGFP-N1-S、pEGFP-N1-LS、pEGFP-N1-MS、pEGFP-N1-HBc、pEGFP-N1-HBx质粒和空pEGFP-N1质粒的细胞相比,转染pEGFP-N1-HBe质粒的细胞Golgi M I的活性明显升高；4.转染pEGFP-N1-HBe质粒的细胞较转染空pEGFP-N1质粒的细胞,MAN1A1、MAN1A2 mRNA和蛋白的表达水平上调,而MANIC1 mRNA和蛋白的表达水平无明显变化。结论：1.HBV感染可通过上调MAN1A1、MAN1A2基因mRNA和蛋白表达的量,从而提高宿主细胞Golgi M I的活性；2. DC-SIGN识别高甘露糖型HBV后可以促进DC的成熟和活化,天然的HBV可能利用Golgi M I参与的去甘露聚糖修饰来逃避DC-SIGN的识别,从而诱导DC功能的缺陷；3.HBV可能通过HBe这一功能蛋白提高宿主细胞Golgi M I的活性,而这一效应可能是通过调控宿主细胞MAN1A1、MAN1A2基因和相应蛋白的表达上调介导的

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 研究背景
• 参考文献
• 第一部分 研究HBV感染与宿主细胞Golgi MI活性的关系
• 摘要
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 DC-SIGN在识别HBV并活化DC中介导作用的研究
• 摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 HBV去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN免疫识别的机制初探
• 摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述 DC对HBV免疫识别的研究进展
• 参考文献
• 附录1 中英文缩略词表
• 附录2 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢