论文摘要
低氧是生命发育的基本环境，如在妊娠的早期，胚胎的发育是处在低氧环境中的，成年哺乳动物的脑组织和骨髓中的氧浓度约为1～4％，均为低氧环境。低氧可诱导大多数细胞或组织中低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）的表达，而HIF-1是细胞低氧反应的核心调控因子，调控着一系列低氧相关基因的表达。神经干细胞（neural stem cell）是一类具有高度自我更新能力和多项分化潜能的神经前体细胞。它在治疗常见的中枢神经系统退行性疾病与缺血性疾病中具有潜在的价值。人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cell，hMSC）是存在于骨髓中的非造血干细胞。由于hMSCs的移植具有多向分化和不发生免疫排斥反应或程度较低的优点，目前被广泛应用于帕金森病等疾病的细胞移植和基因治疗的研究。本研究是建立在本实验室前期研究——持续性低氧（3％O2）可以促进rNSCs和hMSCs体外增殖的基础上，通过基因芯片检测低氧时两种干细胞差异表达基因的变化情况。通过生物信息学分析差异表达基因的结构与功能，并试图探讨低氧促进这两种干细胞增殖的分子机制。1．低氧对大鼠神经干细胞基因表达谱的影响1．1低氧后rNSCs中差异表达基因的数目和功能分类将来源于胚胎E14.5天的大鼠中脑神经干细胞分别在低氧（3％O2）和常氧（20％O2）环境中培养，基因芯片技术分析显示了，低氧24h与72h后，在5705个大鼠基因中有差异表达的基因共有131个，其中24h时的差异表达基因数是71个；72h差异表达基因数是62个。对差异表达的基因进行基因功能分类发现：代谢类基因最多，其次是运输类基因、细胞分化及黏附类基因。1．2 RT-PCR验证HIF-1靶基因和增殖相关的基因由于我们的前期实验证明了低氧促NSC增殖是有HIF-1参与的，我们对131个差异表达基因中，7个已知的HIF-1靶基因（ldha、aldoa、eno1、gapdh、tpi1、pgk1、bnip3）和5个与细胞周期和增殖相关的基因（dnaja2、ccnb1、tgfβ2、ccng1、rgs7）做RT-PCR验证。结果显示：这12个基因的RT-PCR验证结果同芯片结果的一致率为58.3％。1．3生物信息学分析有可能是HIF-1靶基因的差异表达基因通过生物信息学分析预测，在除了已知的7个HIF-1靶基因以外的基因中，我们发现在24h有13个差异表达基因存在HIF-1的靶位点，72h有12个基因存在HIF-1的靶位点，可能也与HIF—1信号途径有关。其中，ppp1cb是在两个时间点上都有差异表达且有HIF-1靶位点的基因。以上结果表明：验证后的7个HIF-1靶基因在24h与72h时都基本上调了，从而进一步证明了本实验室以往研究结论：HIF-1参与了低氧促NSC增殖过程。2．低氧对人骨髓间充质干细胞基因表达谱的影响2．1低氧后hMSCs中差异表达基因的数目和功能分类本研究亦对不同低氧时间内hMSCs芯片上的差异表达基因进行计数和功能分类。结果显示：hMSC基因芯片上共有21329个的基因，其中差异表达基因共有282个，我们发现在24h时差异表达基因最多。在功能分类中结果显示：代谢类基因最多，其次是信号转导类基因、发育类基因和运输类基因。2．2 RT-PCR验证HIF-1靶基因和连续变化差异表达基因本研究从282个差异表达基因中找出了4个已知的HIF-1的靶基因（pgk1、igfbp3、bnip3、tgfβ3），和12个连续变化的基因（hac、bnip3、eests、ndrg1、nefl、tfrc、his1、ddr1、trib3、ahnak、tnfrsf11b、txnip）做RT-PCR验证，发现了它们在36h与72h时变化最多。总的验证率达到84．6％。2．3生物信息学分析有可能是HIF-1靶基因的差异表达基因我们对12个连续变化的基因进行预测，发现在这12个基因中有3个基因存在HIF-1的靶位点，它们分别是：his1、tfrc、ndrg1。我们可以得出以下结论：通过发现已知的4个HIF-1靶基因，它们的差异表达变化与12个连续变化的基因都是在36h与72h时最多，并通过HIF-1靶位点的预测，发现12个连续变化的基因中有3个基因存在HIF-1靶位点。我们推测，HIF-1在低氧促hMSC增殖过程中可能起到了一定的作用。
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