聚乳酸多孔支架的制备、改性及组织工程化软骨的构建

论文摘要

本文研究了聚-L-乳酸（PLLA）软骨组织工程支架的制备、改性及生物相容性。利用热致相分离法和明胶致孔剂法制备了具有三维多孔、高连通性PLLA多孔支架材料。通过层层自组装技术、明胶成孔剂原位改性技术及水凝胶填充技术对支架进行了改性以提高其生物相容性。将改性后的支架植入裸鼠皮下研究支架对于软骨再生的作用。利用传统的相分离法制备了孔径从几微米到150微米变化的PLLA支架。支架的孔径和孔隙率均可以通过调节粗化条件进行控制。通过改进的多步相分离法可以制备孔径大于300微米的大孔支架。多步相分离法和传统方法区别在于其方分离的过程存在差异，相区增长的区域不同。传统的相分离法，随着分相时间的延长，相区不断增长，孔径增大，但相区之间变得愈发孤立。而多步相分离法则是在体系分相一段时间后，再次降低体系的温度，使得新的相分离在原聚合物富相再次发生，随着新形成的聚合物贫相区增大，使得原有相对孤立的聚合物贫相区再次连通，孔径和孔连通性也随着提高。通过电镜和明胶、胶原等大分子物质导入实验也证明了上述结果。利用明胶微球或无规微粒为致孔剂的方法也制备了高连通性、孔形状为球形或无规的PLLA支架。通过乙醇溶液或高温饱和水蒸气，可将明胶微球或微粒相互粘接，再加入PLLA溶液，经冻干或室温下干燥去除溶剂，最后以热水洗去致孔剂明胶即可得到三维的PLLA支架。支架的微结构、连通性可以通过致孔剂进行调控。压缩测试表明冻干支架具有比热干支架更大的机械强度。随着聚合物溶液浓度的提高，支架的孔隙率下降，而机械强度增大。通过层层自组装技术将I型胶原和硫酸软骨素固定到PLLA表面，以提高其生物相容性。通过表面胺解技术使PLLA表面带有正电荷，再通过层层自组装技术将两种分子固定到材料表面。通过紫外光谱跟踪并证明了整个组装过程。软骨细胞培养证明经过层层自组装改性的支架具有更好细胞相容性，如有更高的细胞黏附率，增值率和细胞活性，以及铺展的细胞形态。利用明胶致孔剂可以对PLLA支架进行表面修饰，该过程是在多孔材料制备过程中一次性完成的。以传统致孔剂NaCl微粒制备的PLLA多孔支架作为对照，进行体外细胞培养。结果表明，由于生物大分子明胶的存在，以明胶致孔剂制备的多孔支架具有更好的细胞相容性。以激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜可见更多的软骨细胞。细胞呈铺展状态且有更高的细胞活性和更多的糖胺多糖（GAG）分泌。多孔的聚合物材料及水凝胶均被软骨组织工程所大量使用，两种材料均各有优缺点。为了将这两种材料的优点整合，获得综合性能优异的软骨再生材料，本文发展了水凝胶填充技术对PLLA支架进行改性。将能够维持软骨细胞正常功能的琼脂溶胶导入热致相分离法制备的支架中，考察了导入后支架的各种性能。通过导入水凝胶，支架的力学性能得到了提高。通过扫描电子显微镜及激光共聚焦显微镜的观察发现，体外培养7～14天后，软骨细胞在复合体系中呈天然的球形。并且软骨细胞的细胞活性，胶原和GAG分泌的水平相比未填充琼脂的材料均有更大的提高。同时这种材料还有进一步改性的潜能，可以根据需要，添加水溶性的生物大分子材料，例如明胶，可以进一步提高复合物的生物相容性。最后，对上述几种PLLA多孔材料制备及改性的方法进行了比较，从中挑选了水凝胶填充支架和明胶致孔剂法制备的支架作为动物实验的材料。在裸鼠皮下埋植了4周后，水凝胶填充支架可以保持原有的外形，组织化学染色和组织化学分析表明复合物有更高的胶原GAG分泌，同时可以维持软骨细胞的正常表型。在明胶致孔剂法制备的支架的体内实验中，皮下埋植30天后，有类似于软骨状的组织生成，组织化学染色和组织化学分析也表明在该支架中有理想的胶原GAG分泌。这些结果表明该支架在软骨组织工程中有着很好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 历史回顾
• 1.2 组织工程的诞生和概述
• 1.3 组织工程的研究内容
• 1.3.1 种子细胞
• 1.3.2 组织工程支架
• 1.3.3 组织工程化组织或器官的构建
• 1.3.4 正在构建的组织工程化器官
• 1.4 软骨组织工程及其材料
• 1.4.1 软骨的组织学特点
• 1.4.2 软骨修复面临的问题
• 1.5 组织工程用生物材料
• 1.5.1 组织工程用天然生物材料
• 1.5.2 组织工程用合成生物材料
• 1.5.3 组织工程用复合生物材料
• 1.6 组织工程支架的制备技术
• 1.6.1 组织工程支架概述
• 1.6.2 多孔型支架
• 第二章 热致相分离法制备聚乳酸支架
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 原料和试剂
• 2.1.2 热致相分离法制备聚乳酸多孔支架
• 2.1.3 多步粗化热致相分离法制备聚乳酸多孔支架
• 2.1.4 表征方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 模具和冷却方式的选择
• 2.2.2 溶剂的选择
• 2.2.3 粗化条件对PLLA多孔支架微结构的影响
• 2.2.4 热致相分离技术的改进——多步粗化法
• 2.2.5 多孔支架连通性测试
• 2.2.6 力学性能
• 2.2.7 多孔支架热力学行为测试
• 第三章 明胶致孔剂法制备聚乳酸支架
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 主要原料与试剂
• 3.1.2 明胶微球和无规粒子的制备
• 3.1.3 明胶微球制备PLLA多孔支架
• 3.1.4 无规明胶粒子制备PLLA多孔支架
• 3.1.5 测试与表征
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 明胶微球制备PLLA多孔支架性能研究
• 3.2.2 无规明胶粒子制备PLLA多孔支架性能研究
• 3.2.3 两种致孔剂制备的多孔支架比较
• 3.2.4 不对称聚乳酸多孔支架和管状聚乳酸多孔支架
• 3.3 本章总结
• 第四章 PLLA支架的表面细胞相容性修饰
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 试剂和原料
• 4.1.2 PLLA材料表面胺解
• 4.1.3 PLLA表面层层自组装
• 4.1.4 PLLA平面膜及多孔支架中胶原含量的测定
• 4.1.5 硫酸软骨素（CS）及糖胺多糖（GAG）的测定
• 4.1.6 软骨细胞培养
• 4.1.7 PLLA平面膜和多孔支架上接种软骨细胞
• 4.1.8 软骨细胞相容性的表征
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 PLLA表面分析
• 4.2.2 PLLA平面膜的软骨细胞相容性
• 4.2.3 PLLA多孔支架的细胞相容性
• 4.3 本章总结
• 第五章 明胶致孔剂对PLLA支架的原位表面修饰
• 5.1 实验方法
• 5.1.1 实验材料和试剂
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 支架的结构控制及微观形态
• 5.2.2 支架表面明胶含量
• 5.2.3 细胞形态观察
• 5.2.4 软骨细胞MTT活性的测量
• 5.2.5 细胞分泌物GAG含量的测量
• 5.3 本章总结
• 第六章 填充水凝胶的PLLA仿生复合支架
• 6.1 实验部分
• 6.1.1 原料和试剂
• 6.1.2 水凝胶和聚乳酸多孔支架复合材料的制备与表征
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 水凝胶的导入
• 6.2.2 水凝胶/聚乳酸支架复合物的机械性能
• 6.2.3 水凝胶/聚乳酸支架复合物的生物相容性评价
• 6.3 本章结论
• 第七章 体内构建组织工程化软骨的初步研究
• 7.1 实验部分
• 7.1.1 原料和试剂
• 7.1.2 支架细胞种植与体外培养
• 7.1.3 细胞/支架复合物的植入
• 7.1.4 组织学切片及组织化学染色
• 7.1.5 再生组织中胶原含量及GAG含量测定
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 琼脂/软骨细胞/聚乳酸支架体内培养
• 7.2.2 无规明胶颗粒致孔剂了软骨细胞体内培养
• 7.3 本章总结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介