Na-PCP诱导L-02肝细胞氧化应激和线粒体损伤的实验研究

论文摘要

目的:在体外试验系统（in vitro test）,研究有机氯农药-五氯酚钠（Pentachlorophenol Sodium,Na-PCP）对L-02肝细胞氧化应激和线粒体损伤,为进一步了解五氯酚钠的毒作用机制奠定实验基础。方法:以L-02肝细胞为受试细胞,通过MTT试验检测不同浓度Na-PCP对L-02肝细胞存活率的影响,选择细胞存活率为20%～90%的浓度进行后续实验。设置1个对照组和5个Na-PCP处理组,即12.812mg/L、19.218mg/L、25.624mg/L、32.030mg/L和38.436mg/L,处理时间为24h,采用化学比色法检测Na-PCP对L-02肝细胞超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）活力、谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的影响;采用荧光分光光度法检测Na-PCP对L-02肝细胞线粒体膜电位（△Ψm）和线粒体通透性转运孔（permeability transition pore,PTP）的影响。设置1个对照组和9.609mg/L、12.812mg/L、19.218mg/L三个处理组,处理时间为24h,采用Western Blotting法检测Na-PCP对肝细胞p53、细胞色素C和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）的蛋白水平的影响。结果:1.在9.609mg/L～38.436mg/L浓度范围内,Na-PCP能明显引起L-02肝细胞存活率的降低,且存在着浓度.反应关系（r=-0.978,P＜0.01）。2.与对照组相比,12.812mg/L～38.436mg/L Na-PCP均可导致L-02肝细胞内MDA含量增加（r=0.956,P＜0.01）,SOD活性下降（r=-0.900,P＜0.01）,GSH含量减少（r=-0.975,P＜0.01）。3.与对照组比较,在12.812mg/L～38.436mg/L浓度范围内,随着Na-PCP染毒浓度的增加,线粒体PTP开放度明显增大（P＜0.01）,且PTP开放度与浓度之间呈现明显的浓度-反应关系（r=0.997,P＜0.01）。4.与对照组比较,在12.812mg/L～38.436mg/L浓度范围内,Na-PCP导致荧光吸光度值升高,线粒体膜电位明显降低（P＜0.01）,且膜电位的下降呈浓度依赖性（r=0.795,P＜0.01）。5.经9.609mg/L、12.812mg/L和19.218mg/L Na-PCP处理L-02肝细胞,各组细胞p53、细胞色素C和AIF的蛋白水平明显高于对照组细胞（P＜0.05）。结论:Na-PCP在9.609mg/L～38.436mg/L的浓度范围内,能引起L-02肝细胞存活率下降,诱发氧化损伤,表现为SOD酶活力和GSH含量下降,MDA含量上升。Na-PCP导致肝细胞线粒体膜电位崩溃和通透性转运孔开放度增大,并使得细胞色素C和AIF从线粒体释放增多。Na-PCP导致p53蛋白水平增高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 受试生物
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 试验技术路线
• 2.2.2 L-02肝细胞的培养
• 2.2.3 L-02肝细胞生存率测定
• 2.2.4 五氯酚钠线粒体损伤检测
• 2.2.5 五氯酚钠导致细胞氧化损伤检测（化学比色法）
• 2.2.6 p53蛋白、AIF和细胞色素C的免疫印迹分析
• 2.3 统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 五氯酚钠对L-02肝细胞存活率的影响
• 3.2 五氯酚钠对L-02肝细胞线粒体的影响
• 3.2.1 五氯酚钠对L-02肝细胞线粒体膜通透性转运孔（PTP）的影响
• 3.2.2 五氯酚钠对L-02肝细胞线粒体膜电势△ψm的影响
• 3.3 五氯酚钠对L-02肝细胞氧化与抗氧化系统的作用
• 3.4 五氯酚钠对L-02肝细胞P53、细胞色素C和AIF蛋白水平的影响
• 第四章 分析与讨论
• 4.1 五氯酚钠导致L-02肝细胞氧化损伤
• 4.2 五氯酚钠诱导L-02肝细胞P53蛋白的表达
• 4.3 五氯酚钠对L-02肝细胞线粒体的损伤
• 4.3.1 五氯酚钠对线粒体膜通透性转运孔（PTP）的影响
• 4.3.2 五氯酚钠导致L-02肝细胞线粒体膜电位的影响
• 4.3.3 五氯酚钠导致L-02肝细胞线粒体释放细胞色素C
• 4.3.4 五氯酚钠导致L-02肝细胞线粒体释放AIF
• 4.4 五氯酚钠诱导肝细胞氧化应激和线粒体的损伤作用机制探讨
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果