cAMP受体蛋白调控鼠疫耶尔森氏菌毒力的研究

论文摘要

鼠疫是一种烈性自然疫源性疾病,人类历史上,曾经发生过3次鼠疫的世界性大流行。自上世纪90年代以来,鼠疫的发病呈上升趋势,2000年开始,世界卫生组织（WHO）将鼠疫列为重新抬头的传染病。另外,鼠疫菌是传统的生物性战剂之一,还是恐怖分子制造生物恐怖的首选微生物之一。鼠疫在中国的流行也很严峻,疫源地约占国土面积的15%,主要分布在我国的西北部,对人们的生命和财产造成巨大的威胁。鼠疫的病原菌是鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）,在自然界,鼠疫的主要宿主是啮齿动物,主要通过节肢动物蚤的叮咬在宿主之间传播。通过蚤叮咬或者其它途径,鼠疫可以传染给人,引发腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫。鼠疫菌从鼠蚤传播到新的宿主过程中,经历了温度,渗透压,离子浓度,PH,氧等信号的改变,鼠疫菌必须适应相应的环境压力才能存活并维持其毒力和致病性,而每个适应性反应也必然伴随着鼠疫菌基因转录的改变,这体现在:很多特定的调控子,分别感应特定的外界信号,介导特定基因（包括毒力基因）表达的上调和下调,最终组成复杂的毒力调控网络,控制鼠疫菌在媒介和贮存宿主中生存能力和致病力。cAMP受体蛋白（cAMP receptor protein,CRP）作为细菌调控子能调控E.coli的100多个基因,包括参与分解代谢抑制的基因。在本实验中,我们构建了鼠疫菌201株的crp突变株（△crp）和回复株。通过体内外的毒力表型实验证实了CRP的毒力调控表型。利用比较芯片表达谱分析生长在TMH-1mM cAMP中的鼠疫菌201株和△crp的差异表达基因,根据E.coli CRP的基序的特点,用生物信息学的方法预测可能受CRP直接调控的靶基因38个,进一步用实时定量RT-PCR和EMSA（凝胶阻滞实验）来验证确定CRP的最小调控元。在此基础上,选取水平转移获得的毒力相关的质粒基因pla,pst和操纵子sycO-ypkA-yopJ进行精细调控机制的研究。通过体内的LacZ报告基因融合实验证明CRP对pla,pst和ypkA有直接调控作用,然后分别用引物延伸实验（Primer extension assay）和DNase I足迹实验（DNase I footprinting assay）确定上述毒力基因启动子区的转录起始位点,核心启动子元件和CRP结合位点序列,揭示上述基因的启动子区的结构图。表型实验显示crp的突变在体内和体外均影响突变株的生长,体外的生长曲线显示△crp的倍增时间长于WT,体内实验证明皮下途径感染时突变株的毒力比相应的野生株下降了15,000多倍,而静脉途径感染时,突变株的毒力大约下降了40倍。因此CRP是鼠疫菌毒力所必须的,并且在皮下感染途径中更重要。体内实验证实crp突变株的生长减慢可能是导致两种感染途径中突变株毒力减弱的部分原因。而相应的回复株能恢复crp缺失株的毒力表型,达到与野生株的毒力表型一致的水平。先前的实验证明由Pla编码的纤维蛋白酶原激活剂能特异性的促进鼠疫菌从外周感染部位（皮下感染[跳蚤叮咬]或者吸入）扩散。以上的实验证据都说明crp突变株中pla的表达缺失除了能降低体内的生长表型外,还能大大降低该突变株在皮下感染途径中的毒力。在本实验中,用鼠疫全基因组芯片采用双色荧光的比较芯片表达谱实验分析生长在TMH-1mM cAMP中的鼠疫菌田鼠型的野生株和△crp,筛选出278个差异表达基因,其中△crp相比于野生株（WT）,有104个基因表达上调,174个下调。汇总E.coli CRP结合位点,用consensus-matrix和convert-matrix程序计算CRP结合序列每个位置四个碱基出现的权重,得到CRP结合序列的Matrix,进而用WebLogo软件展示序列logo,最终预测得到CRP结合box:TGTGA-N6-TCTCA。利用Matrix scan程序查找278个差异表达基因中的保守CRP基序,找到38个与基序匹配分值高（以8为界值）的基因作为候选可能受CRP直接调控的靶基因。后续的实时定量RT-PCR和凝胶阻滞实验（EMSA）显示有36个基因或者假定的操纵子受CRP直接调控,构成了鼠疫菌CRP的最小调控元,其中YPO2468的芯片表达谱结果与实时定量RT-PCR不一致,而yopD虽然芯片表达谱,实时定量RT-PCR,EMSA以及足迹实验都证实可能为CRP调控元,但引物延伸和lacZ报告基因融合实验并未发现CRP对yopD有直接调控作用,因此这两个基因不是CRP调控元。pla,pst和ypkA的lacZ融合实验证实CRP能正调控水平获得的质粒基因pla,pst,而负调控ypkA。通过引物延伸实验（Primer extension assay）和DNase I足迹实验（DNase I footprinting assay）定位了pla,pst和sycO-ypkA-yopJ操纵子的转录起始位点,核心启动子元件（-10和-35区）和CRP结合位点,三者一起揭示了CRP与pla,pst,sycO-ypkA-yopJ启动子DNA相互作用的结构图。pla,pst的CRP位点均位于启动子区-35区的上游,cAMP-CRP与启动子DNA结合后,促进RNA聚合酶的转录,表现为激活转录作用。鼠疫菌中的sycO,ypkA和yopJ基因组成一个三联体的操纵子,sycO-ypkA-yopJ操纵子上仅有一个受CRP调控的启动子,但是启动子上有2个CRP结合位点（位点1和位点2）,并且只在位点1上找到CRP box的同源序列,说明位点1是真正的CRP位点,而位点2应该是无效位点。而sycO的CRP位点则位于-10区的下游,阻碍了RNA聚合酶的转录延伸,因此表现为抑制调控作用。无论是CRP蛋白还是pla,pst和sycO-ypkA-yqpJ启动子区,其在4种鼠疫菌生物型中,即古生型,中世纪型,东方型和田鼠型,是相当保守的。因此,本研究中的田鼠型鼠疫菌的结果可以普遍运用于其它鼠疫生物型中。通过上述实验,不仅首次界定了鼠疫菌田鼠型的CRP最小调控元,推测出CRP可能的调控元。结合相应的体内外表型实验,进一步证实并精细研究了CRP直接调控毒力基因pla,pst和sycO-ypkA-yopJ操纵子的机制。CRP毒力调控作用的确定,为鼠疫菌的药物的研制提供了新的靶点,必将对鼠疫的防治起重要的积极作用。

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前言

1.鼠疫的危害

2.鼠疫菌的传播和治病过程

3.鼠疫菌的病原学特征

3.1 生理生化特性

3.2 基因组的结构及整体调节

3.3 毒力决定因子

3.3.1 血浆酶原激活因子（Pla蛋白酶）

3.3.2 鼠疫杆菌素Pst

3.3.3 鼠疫菌的Ⅲ型分泌系统

4.细菌基因表达调控

4.1 细菌生物的基因调控特点

4.2 细菌基因调控机制的类型与特点

4.3 细菌的转录调控子与基因调控

4.4 细菌毒力相关的转录调控子

5.鼠疫菌的基因调控研究概况

6.CRP的研究及进展

6.1 降解物对基因活性的调节

6.2 CAP的正性调控

6.3 转录调控子CRP的研究进展

7.本研究的目的与总体研究计划

正文

1.材料

1.1 菌株,质粒

1.1.1 菌株

1.1.2 质粒

1.2 酶,试剂盒

1.3 主要仪器

2.方法

2.1 △crp突变株的构建

2.1.1 突变盒引物的设计与突变盒的扩增

2.1.2 感受态细胞的制备

2.1.3 电转化

2.1.4 重组克隆的筛选鉴定

2.2 △crp突变株的回复株C-crp的构建

2.3 鼠疫菌毒力表型实验

2.3.1 体外生长曲线

2.3.2 动物实验LD50的测定

2.3.3 鼠疫菌细菌的脏器分布

2.4 芯片表达谱分析

2.4.1 培养条件

2.4.2 鼠疫菌总RNA的提取

2.4.2.1 菌体收集和RNA固定

2.4.2.2 菌体裂解

2.4.2.3 沉淀核酸

2.4.2.4 消化DNA

2.4.2.5 沉淀RNA

2.4.3 总RNA的荧光素标记

2.4.3.1 逆转录生成氨基标记的cDNA

2.4.3.2 氨基标记cDNA纯化

2.4.3.3 氨基标记cDNA的荧光素标记与纯化

2.4.4 芯片杂交及数据分析

2.4.4.1 芯片的紫外交联与醛基封闭

2.4.4.2 芯片的预杂交

2.4.4.3 芯片杂交与漂洗

2.4.4.4 数据分析

2.5 Real-time PCR验证

2.5.1 Trizol提取细菌RNA的方法

2.5.2 Ambion's DNA-freeTM kit 去DNA污染

2.5.3 逆转录

2.5.4 Real-time PCR反应

2.5.4.1 设计引物

2.5.4.2 定量PCR

2.5.4.3 绘制相对标准曲线和待测基因的定量PCR验证

2.6 CRP结合位点的生物信息学预测

2.7 acZ报告基因融合实验

2.7.1 设计引物

2.7.2 原理见下图6

2.7.3 目的DNA扩增和产物纯化

2.7.4 pRS551质粒DNA的提取

2.7.5 启动子DNA和载体DNA的双酶切

2.7.6 酶切产物的连接

2.7.7 感受态制备

2.7.8 转化

2.7.9 重组克隆鉴定

2.7.10 克隆片段DNA测序

2.7.11 质粒DNA提取

2.7.12 鼠疫菌电转化感受态细胞的制备

2.7.13 电转化

2.7.14 PCR鉴定

2.7.15 LacZ酶活性检测

2.8 his-CRP蛋白的表达与纯化

2.8.1 引物设计及合成

2.8.2 产物的扩增与连接

2.8.3 连接产物转化感受态大肠杆菌BL21

2.8.4 阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达

2.8.5 目的蛋白的表达纯化

2.8.5.1 菌体培养和诱导

2.8.5.2 Ni柱纯化

2.8.6 透析和浓缩

2.8.7 BCA法测定CRP蛋白浓度

2.9.凝胶迁移实验

2.9.1 目的DNA片段的合成

2.9.2 探针的标记

2.9.3 结合百分比的测定

2.9.4 未结合标记物的去除

2.9.5 结合反应

2.10 DNA酶Ⅰ足迹实验

32P-ATP标记引物'>2.10.1 放射性γ-³²P-ATP标记引物

2.10.2 靶DNA的标记

2.10.3 足迹试验步骤

32P-ATP标记引物及测序反应'>2.11 放射性γ-³²P-ATP标记引物及测序反应

32P-ATP标记引物'>2.11.1 用放射性γ-³²P-ATP标记引物

2.11.2 测序反应

2.12 引物延伸实验

2.12.1 与靶基因mRNA互补引物的设计

2.12.2 总RNA的提取

2.12.3 寡核苷酸探针的制备

2.12.4 引物延伸反应

3.结果

3.1 △crp突变株及回复株-ccrP的构建

3.2 毒力表型实验

3.2.1 生长曲线

3.2.2 LD50测定

3.2.3 攻毒后小鼠生存率曲线

3.2.4 细菌在脏器中分布

3.3 CRP调控元

3.3.1 芯片表达谱实验

3.3.2 候选直接调控靶基因的预测

3.3.3 实时定量RT-PCR

3.3.4 his-CRP蛋白的表达纯化和浓度的测定

3.3.5 凝胶阻滞实验

3.3.6 小结

3.4 CRP对关键毒力基因调控的精细机制

3.4.1 sycO-ypkA-yopJ操纵子的验证

3.4.2 lacZ融合实验

3.4.3 足迹实验

3.4.4 引物延伸实验

3.4.5 靶基因启动子区的结构

3.4.5 CPR依赖的pal,sPt以及syco-ypkA-yopJ划少即J的启动子区的结构

3.4.6 小结

3.5 CRP基序的生物信息学分析

3.5.1 CRP Box

3.5.2 CRP Matrix

3.5.3 全基因组生物信息学预测

4.讨论

4.1 CRP是一个整体调控子

4.2 CRP能激活两个水平转移获得的质粒pPCP1上的基因pla和pst

4.3 CRP和sycO-ypkA-yopJ操纵子

4.4 Y.pestis中的CRP是一个毒力调控子

4.5 CRP调控机制的小结

5.结语

参考文献

附录

1.药品,溶液,药品,配制方法

2.本研究中所用到的引物

3.缩略语

致谢

攻博期间主要学术成果

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