联合应用反义Bcl-xl和反义Mcl-1寡核苷酸对恶性黑素瘤细胞多药耐药性影响的研究

论文摘要

目的:恶性黑素瘤是一种高度恶性的肿瘤,对临床治疗反应不佳,预后差,死亡率高。而多药耐药是其临床化疗失败的主要原因,因此,逆转肿瘤的耐药性是治疗恶性黑素瘤的重要课题。现有研究已证实凋亡及其调节因子是决定恶性黑素瘤耐药的重要机制。抗凋亡基因的过度表达使化疗药物不能发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的作用,致使恶性黑素瘤化疗耐药。其中以抗凋亡基因Bcl-2相关蛋白的作用尤为引人注目。Bcl-2基因家族促进凋亡基因和抑制凋亡基因之间的平衡决定细胞存活和凋亡。Bcl-xl和Mcl-1基因都是Bcl-2家族中的抗凋亡基因,与细胞凋亡调节及肿瘤的发生、发展密切相关。近年国外研究发现,利用反义核酸下调Bcl-xl或Mcl-1基因的表达可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。我们前期工作也显示Mcl-1反义寡核苷酸可部分逆转恶性黑素瘤的耐药性。但基于肿瘤是多基因多途径共同作用的结果,肿瘤的耐药性也可能涉及多个基因的改变。因此,设想联合应用Bcl-2基因家族中具有抗凋亡作用基因的反义寡核苷酸,如针对Bcl-xl和Mcl-1的反义寡核苷酸,有可能更有效逆转恶性黑素瘤的耐药性。本实验通过脂质体介导的Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸联合转染恶性黑素瘤细胞WM451,观察其诱导恶性黑素瘤细胞WM451凋亡及逆转恶性黑素瘤化疗耐药的情况,旨在探讨联合应用反义寡核苷酸逆转恶性黑素瘤耐药性的优越性,为恶性黑素瘤的靶向联合治疗提供依据。方法:利用阳离子脂质体将Bcl-xl和Mcl-1反义核酸导入恶性黑素瘤细胞WM451;利用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法观察转染前后Bcl-xl及Mcl-1基因的表达情况;Western-blot法及免疫组化检测肿瘤细胞转染前后Bcl-xl及Mcl-1蛋白的表达情况;电镜检测转染后凋亡细胞形态;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。结果:1联合转染Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸后,Bcl-xl mRNA表达量和Mcl-1 mRNA的表达量均下降。2 Western-blot检测显示联合转染Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸可下调Bcl-xl蛋白和Mcl-1蛋白水平。3联合转染Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸可显著增加WM451细胞凋亡率,电镜超微结构观察显示反义寡核苷酸组细胞呈现典型凋亡特征。4转染Bcl-xl反义寡核苷酸组氮烯咪胺的IC50值从152.74ug/ml降至83.33 ug/ml;转染Mcl-1反义寡核苷酸组氮烯咪胺的IC50值从152.74ug/ml降至92.63 ug/ml;联合转染Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸组,氮烯咪胺的IC50值从152.74ug/ml降至64.34 ug/ml;结果表明Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸单独或联合均能增加WM451对氮烯咪胺的敏感性,而且与单独转染Bcl-xl或Mcl-1反义寡核苷酸组相比,联合应用Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸能更有效逆转WM451细胞对DTIC的耐药性（P<0.05）。5单独转染Bcl-xl或Mcl-1反义寡核苷酸组与联合应用Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸组对顺铂IC50值的影响与正义,无义及对照组相比,无显著性差异（P>0.05）。结论:1 Bcl-xl和/或Mcl-1反义寡核苷酸可通过下调Bcl-xl和/或Mcl-1表达而诱导WM451细胞凋亡。2 Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸单独或联合应用均可增加WM451细胞对氮烯咪胺的敏感性,部分逆转恶性黑素瘤细胞的化疗耐药性,表明Bcl-xl和Mcl-1可作为恶性黑素瘤基因治疗的新靶点。3联合应用Bcl-xl和Mcl-1反义寡核苷酸较单独应用Bcl-xl或Mcl-1反义寡核苷酸逆转WM451细胞耐药性效果更佳。这一结果为临床联合应用反义寡核苷酸靶向治疗提供了实验依据。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料和方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢