菰DNA渐渗诱导水稻内源LTR类反转座子的遗传和表观遗传变异

论文摘要

种间杂交在植物基因组进化过程中起到重要作用,也是一种被广泛应用的育种方法。物种间的远缘杂交将2个高度分歧的基因组综合到一个“核-质”中对基因组来说是一种强烈的冲击,能够引起广泛的遗传和表观遗传变异。本文利用水稻13个内源低拷贝、具有潜在转座活性的反转座子的RT和/或LTR区为探针,对反转座子自身在3种水稻-菰（Zizania latifolia Griseb.）渐渗系（RZ1、RZ2和RZ35）中的遗传变异和DNA甲基化变异,及反转座子侧翼序列基因表达进行了研究。首先,对反转座子的RT和LTR两个区域的拷贝数估测结果表明,LTR的拷贝数高于RT的2倍,说明水稻和菰中都有这些反转座子的solo-LTR的存在。经EcoRI和HindIII酶切的Southern杂交结果表明,13个反转座子中的10个在3种水稻-菰渐渗系中均检测到广泛的基因组结构变异。这些变异主要表现为渐渗系中亲本杂交片段的消失和新片段的出现,这提示变异的性质主要是重组。在这10个反转座子中,有8个在RT和LTR区域同时发生了具有明显协同性的重组性变异,余下的2个只在RT区检测到了变异。经一对胞嘧啶甲基化敏感的同位酶HpaII和MspI酶切的Southern杂交结果表明,所研究的13个反转座子中,有12个在3种水稻-菰渐渗系中均发生了广泛的DNA甲基化变异,包括超甲基化和去甲基化变异。这12个发生了甲基化变异的转座子中,11个在RT区和LTR区同时发生了甲基化变异,1个在仅在RT区发生甲基化变异。研究发现,无论是结构变异还是DNA甲基化变异,多数在2种或所有的3种渐渗系中具有一致性。由于所研究的3种渐渗系最初来自于同一个F1植株,说明渐渗系中的大多数变异发生在F1植株发育早期的体细胞中,此后通过形成生殖细胞而遗传给后代。对这13个LTR类反转座子反转录酶区的RT-PCR结果分析表明,1个反转座子（Osr7）在松前和3种渐渗系中在转录水平上都有活性,1个反转座子（Osr42）在松前和渐渗系RZ35中有转录活性。亚硫酸盐测序结果进一步证实了渐渗系甲基化变异,而且揭示反转座子Osr42的表达与甲基化程度密切相关。对这13个LTR类反转座子的上、下游侧翼5kb范围内的序列分析结果表明,71.4%为多拷贝序列,仅少数序列为单拷贝序列,说明这些反转座子主要位于异染色质区,但在基因附近也有少量分布。对侧翼序列中的9个低拷贝基因进行RT-PCR分析结果表明,3个基因在渐渗系和受体水稻亲本之间存在差异表达,但与反转座子的存在与否没有直接相关性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 植物远缘杂交的研究进展
• 1.1 远缘杂交与新种的形成
• 1.2 远缘杂交引起基因组遗传变异
• 1.3 远缘杂交引起基因组甲基化变异
• 1.4 远缘杂交引起基因表达的改变
• 1.5 远缘杂交可激活沉默的转座元件
• 2 转座子的分子生物学研究进展
• 2.1 转座子及其结构特点
• 2.2 转座子与基因组进化
• 2.3 转座子的应用
• 3 DNA 甲基化的分子生物学研究进展
• 3.1 DNA甲基化
• 3.2 DNA去甲基化
• 3.3 DNA甲基化的生物学功能
• 3.4 转座子活性与DNA甲基化的关系
• 4 本研究的目的、背景和意义
• 材料和方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 实验材料的获得
• 2.2 植物基因组DNA的提取与纯化
• 2.3 Southern 杂交分析
• 2.4 LTR类反转座子插入位点侧翼序列的克隆和序列分析
• 2.5 PCR产物的纯化与克隆
• 2.6 感受态细胞的制备、转化及α互补筛选
• 2.7 DNA序列测定、同源性探寻及LTR类反转座子侧翼序列表达序列同源性分析
• 2.8 亚硫酸盐测序
• 2.9 植物总RNA的提取与RT-PCR
• 结果与分析
• 1.菰DNA 渐渗诱导渐渗系RZ1、RZ2 和RZ35 中LTR 类反转座子发生结构变异
• 1.1 Southern Blot估测LTR类反转座子的RT和LTR在松前和菰中的拷贝数
• 1.2 菰DNA渐渗诱导水稻中LTR类反转座子发生重组
• 2 菰DNA 渐渗诱导渐渗系RZ1、RZ2 和RZ35 中LTR 类反转座子发生高频率的DNA 甲基化变异
• 3 LTR 类反转座子在转录水平上的活性
• 4 亚硫酸盐测序
• 4.1 LTR 类反转座子Osr7、Osr42、Osr43 中CpG、CpHpG 甲基化发生频率高于CpHpH
• 4.2 菰DNA 渐渗诱导水稻内源LTR 类反转座子发生超甲基化和去甲基化变异
• 5 松前、渐渗系基因组中反转座子对侧翼序列表达的影响
• 5.1 利用反转座子展示技术克隆到13个LTR类反转座子位点
• 5.2 LTR类反转座子侧翼基因的表达分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况