论文摘要
研究背景:胰腺癌是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤,在引起人类死亡的十大恶性肿瘤中占第8位,全世界每年有22.7万人死于此病,其发生率在男性和女性分别为0.007%-0.009%和0.0045%-0.006%,并且有逐年增加的趋势。手术切除是可能治愈此病的唯一方法,然而胰腺癌由于起病隐匿、发展迅速,85%的患者就诊时已属晚期,故只有10%左右的患者在就诊时获得切除机会。手术切除的病人术后也多发生复发和转移,故胰腺癌的预后极差,总体5年生存率低于1%,确诊后平均生存时间不超过6个月。化疗是胰腺癌重要的辅助治疗手段,对于改善生存质量,延长生存期有很大作用。但用严格的标准,目前胰腺癌化疗的最高反应率仅为20%。所以寻找新型抗胰腺癌药物成为基础和临床研究的重点。和厚朴酚（Honokiol）是从传统中药厚朴的根皮、枝皮中,提取分离的一种带有烯丙基的连苯二酚类化合物,是厚朴的主要有效成分之一,它具有多种药理作用,包括抗炎、抗血栓、抗氧化、抗焦虑等。近几年来,有研究表明和厚朴酚也可诱导某些人类肿瘤细胞的凋亡。且和厚朴酚可以克服人多发性骨髓瘤细胞对传统化疗药物的抵制,诱导其凋亡,同时也有研究表明,与正常外周单个核细胞相比,肿瘤细胞对和厚朴酚诱导的凋亡更加敏感。故和厚朴酚在胰腺癌的化学治疗中也许有一定的应用前景。目前,和厚朴酚在胰腺癌中的治疗作用还没有研究。因此了解和厚朴酚对胰腺癌的作用及机制,有助于我们在未来合理有效地应用其治疗胰腺癌。第一部分和厚朴酚对人胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响研究目的:明确和厚朴酚能否在体外抑制人胰腺癌PANC-1细胞的生长,研究和厚朴酚对PANC-1细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。研究方法:1、MTT法检测和厚朴酚对PANC-1细胞生长的作用。2、流式细胞仪检测和厚朴酚对PANC-1细胞细胞周期的影响。3、流式细胞仪检测和厚朴酚对PANC-1细胞凋亡发生率的影响。研究结果:1、和厚朴酚对PANC-1细胞生长的抑制作用MTT法检测和厚朴酚对PANC-1细胞生长的影响。不同剂量和厚朴酚（2.5、5、10、15、20、30、40、50μg/ml）作用于PANC-1细胞12h后,细胞增殖抑制率范围为0.88%～59.97%,而24和48h处理后细胞增殖抑制率范围分别为3.13%～79.91%和7.66%～92.97%。该结果提示,和厚朴酚在体外能以剂量和时间依赖方式明显地抑制PANC-1细胞生长。2、和厚朴酚对PANC-1细胞周期的影响10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml和厚朴酚处理PANC-1细胞24h以后,用流式细胞仪检测细胞周期的变化情况。结果显示,对照组PANC-1细胞的G1期、S期和G2期比例分别为:47.33%±2.52%、36.82%±0.89%和15.85%±1.41%,经10、20和40μg/ml和厚朴酚处理,G1期细胞比例逐渐增加,分别为:57.87%±1.43%、72.95%±1.96%和77.08%±1.58%;S期的细胞比例减少,分别为:27.62%±1.04%、13.10%±1.81%和15.07%±0.99%;G2/M期的细胞有下降趋势,分别为:14.51%±2.21%、13.95%±1.06%和7.85%±0.46%,表明和厚朴酚可使细胞阻滞于G1期。3、和厚朴酚对PANC-1细胞凋亡的影响分别将10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml和厚朴酚作用于PANC-1细胞,并设对照组,24h以后流式细胞仪检测细胞凋亡。对照组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为:2.38%±1.65%和1.26%±0.23%,经10、20和40μg/ml和厚朴酚处理后,PANC-1细胞的早期凋亡率分别为:7.8%±1.56%、9.0%±0.64%、19.4%±1.09%;PANC-1细胞的晚期凋亡率分别为:11.34%±0.76%;31.23%±1.76%;40.98%±2.31%。结论:和厚朴酚对胰腺癌PANC-1细胞的生长有明显抑制作用,细胞凋亡和细胞G1期阻滞是其主要机制。第二部分和厚朴酚的体外抗胰腺癌转移活性的研究研究目的:研究和厚朴酚对胰腺癌PANC-1细胞体外粘附、迁移、侵袭的影响。研究方法:1、细胞-基质粘附实验检测和厚朴酚对PANC-1细胞迁移能力的影响。2、划痕实验检测和厚朴酚对PANC-1细胞迁移能力的影响。3、Transwell小室重建基底膜侵袭实验分析和厚朴酚对PANC-1细胞侵袭能力的影响。研究结果:1、和厚朴酚对PANC-1细胞体外粘附的影响经和厚朴酚（10、20、40μg/ml）作用24h后,PANC-1细胞与纤维连接蛋白（Fibronection,Fn）的粘附作用减弱了,其效应呈浓度依赖性。和厚朴酚10、20和40μg/ml剂量下肿瘤细胞粘附抑制率分别为20.01%±1.56%,42.78%±3.89%,65.34%±2.67%。2、和厚朴酚对PANC-1细胞体外迁移的影响划痕实验表明经和厚朴酚（10、20、40μg/ml）作用24h后,PANC-1细胞的迁移能力逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。3、和厚朴酚对PANC-1细胞体外侵袭的影响Transwell小室重建基底膜侵袭实验表明:和厚朴酚与PANC-1细胞作用24h后,细胞穿越基底膜的能力显著低于对照组,细胞侵袭数与药物浓度成反比。和厚朴酚10、20和40μg/ml剂量下PANC-1细胞侵袭百分比分别为76.34%、52.72%、26.54%。结论:和厚朴酚可显著抑制PANC-1细胞的粘附、迁移和侵袭能力。第三部分和厚朴酚体外抗胰腺癌的机制研究研究目的:研究和厚朴酚诱导PANC-1细胞凋亡、细胞G1期阻滞和抑制体外侵袭能力的分子机制。研究方法:1、Western blot法检测和厚朴酚对caspase-8、procaspase-9、细胞色素C、procaspase-3和PARP蛋白表达的影响。2、Western blot法检测和厚朴酚对Bcl-XL、Bcl-2、Bad和Bax蛋白表达的影响。3、Western blot法检测和厚朴酚对Cyclin D1和CDK4蛋白表达的影响。4、Western blot法检测和厚朴酚对MMP9蛋白表达的影响。5、Western blot法检测和厚朴酚对MAPK及PI3K/Akt通路的影响。6、MTT法检测p38MAPK通路抑制剂（SB 203580）和ERK通路抑制剂（PD98059）对和厚朴酚抑制PACN-1细胞生长的影响。7、Western blot法检测SB 203580和和厚朴酚共同作用后PANC-1细胞cleaved-caspase-3、Cyclin D1和CDK4的表达。研究结果:1、和厚朴酚对caspase家族成员及细胞色素C蛋白表达的影响Western bolt法表明:procaspase-9,procaspase-3在10、20和40μg/ml和厚朴酚处理24h后,其表达水平明显下降,而caspase-8表达无明显变化。另外,细胞色素C释放到细胞浆明显增加,PARP在处理组细胞被剪切,可见断裂带的产生。表明和厚朴酚通过内在凋亡途径诱导PANC-1细胞凋亡。2、和厚朴酚对Bcl-2家族成员蛋白表达的影响10、20和40μg/ml和厚朴酚处理使PANC-1细胞的Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达水平显著下降;Bad的表达增加;而Bax蛋白表达无明显变化。3、和厚朴酚对Cyclin D1和CDK4表达的影响和厚朴酚（10、20和40μg/ml）作用24h后,随药物浓度的增加,PANC-1细胞Cyclin D1和CDK4的表达逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。4、和厚朴酚对MMP9表达的影响和厚朴酚（10、20和40μg/ml）作用24h后,PANC-1细胞的MMP9表达逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。5、和厚朴酚对MAPK和PI3K/AKT通路的影响40μg/ml和厚朴酚处理PANC-1细胞可活化p38MAP激酶,并且随时间的延长,其磷酸化水平更高,在0.5h时达高峰,且这一活性高峰维持到6h,同时和厚朴酚呈时间依赖性的减少了ERK的磷酸化水平,但和厚朴酚对JNK通路和PI3K/Akt无明显作用。这表明ERK和p38MAP信号通路可能在和厚朴酚抗胰腺癌中起一定作用。6、p38MAPK通路抑制剂（SB 203580）和ERK通路抑制剂对和厚朴酚抑制PACN-1细胞生长的影响MTT实验表明SB 203580可明显逆转和厚朴酚对PANC-1细胞的生长抑制作用,而PD98059对和厚朴酚抑制PANC-1细胞生长的作用没有影响,和厚朴酚组（40μg/ml）、和厚朴酚（40μg/ml）+SB203580（10μM）组及和厚朴酚（40μg/ml）+PD98059（25μM）的细胞存活率分别为31.02%±2.06%、83.64%±1.89%和35.78%±3.68%。7、SB 203580与和厚朴酚共同作用对PANC-1细胞表达cleaved-caspase3、Cyclin D1和CDK4的影响40μg/ml和厚朴酚可使caspase3活化,出现剪切片段。而经SB203580预处理后,和厚朴酚致caspase3活化的作用明显被抑制。同时,也发现SB203580可逆转和厚朴酚致Cyclin D1和CDK4表达下降的作用。结论:和厚朴酚通过活化p38MAPK通路导致细胞通过内在途径发生凋亡和细胞周期G1期阻滞。p38MAPK通路活化导致抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达减少,促凋亡蛋白Bad表达增加,致细胞色素C释放到细胞浆增多、活化caspase9和caspase3,使PARP剪切。p38MAPK通路活化也可导致Cyclin D1和CDK4表达下降从而导致细胞发生G1期阻滞。第四部分和厚朴酚对PANC-1细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究研究目的:研究和厚朴酚的体内抗胰腺癌作用和机制。研究方法:1、建立PANC-1细胞裸鼠异种移植瘤模型,观测和厚朴酚对肿瘤生长的作用。2、HE染色检查和厚朴酚对胰腺癌肿瘤病理学形态的影响。3、免疫组化检测和厚朴酚对VEGF表达的影响。研究结果:1、和厚朴酚对PANC-1细胞裸鼠异种移植瘤作用和厚朴酚可明显抑制PANC-1荷瘤鼠移植瘤在体内的生长,生理盐水组、二甲基亚砜（DMSO）组和和厚朴酚组第30d时肿瘤的体积分别为:4.456±1.93cm3、4.765±1.67cm3和2.641±1.03cm3。生理盐水组、DMSO组和和厚朴酚组第30d时肿瘤的重量分别为:2.354±0.634g、2.198±0.567g和1.095±0.302g,和厚朴酚的抑瘤率达53.5%。2、和厚朴酚对胰腺癌肿瘤病理学形态的影响取移植瘤常规组织病理切片镜检,镜下移植瘤细胞形状不规则,大小不一,核大,浓染,核异形性明显,可见病理性核分裂相,核质比例明显增大。和厚朴酚组癌细胞出现不同程度的退变,肿瘤中可见片状及散在点状坏死和凋亡。3、和厚朴酚对移植瘤VEGF表达的影响VEGF主要表达于肿瘤细胞内,VEGF的阳性表达位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜,部分血管内皮细胞也可出呈阳性表达。生理盐水组和DMSO组的VEGF表达水平明显高于和厚朴酚组,表明和厚朴酚可减少新生血管生长因子VEGF的表达。结论:和厚朴酚可明显抑制胰腺癌在裸鼠体内的生长,其机制可能与肿瘤内VEGF的表达被抑制有关。