小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件及核糖体DNA多态性分析

论文题目: 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件及核糖体DNA多态性分析

论文类型: 硕士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 弭娜

导师: 刘振钦,陈万权

关键词: 小麦矮腥黑粉菌,冬孢子萌发,核糖体

文献来源: 吉林农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 小麦矮腥黑穗病(Dwarf bunt of wheat)是由小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa kuhn，简称TCK)引起的一种系统侵染性病害，是世界小麦生产上最具有破坏性的小麦病害之一，同时也是重要的国际检疫性病害。自20世纪70年代以来，该病害一直是中美小麦贸易中的焦点问题，所以引起了我国政府部门及科研部门的高度重视。然而在生物学性状上，小麦矮腥黑粉菌的形态与小麦网腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌等多种腥黑粉菌极为相似，尤其是与小麦网腥黑粉菌的冬孢子形态特征明显交叉重叠，难以区分，传统的病害诊断、检测方法主要依据病原形态学、生理学和病害症状学等特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，研究开发快速、准确的病害分子诊断、检测技术，对于防止该病害的传入、扩散和蔓延，确保我国小麦安全生产具有重要的理论意义和应用价值。本研究对小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件进行了初步研究。采用水琼脂培养基、土壤浸提液培养基、T19固体培养基培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，结果表明该病菌冬孢子在三种培养基上均能萌发，以土壤浸提液培养基为最适萌发培养基，冬孢子萌发的最适菌悬液浓度约为50万个／mL，一般20天后冬孢子开始萌发，35-50天时萌发达到高峰期。小麦矮腥黑粉菌菌悬液(浓度为50万／mL)经不同时间、不同浓度NaC10处理，可以得到不同结果，本试验发现0.3MNaC10处理30min的菌悬液，其萌发率最高。研究中还对小麦矮腥黑粉菌菌丝体进行了培养，试验表明：通常冬孢子在萌发35-40天时，将萌发的冬孢子可转置液体培养基中培养。PDA培养基和T19液体培养基均可培养菌丝体，PDA培养基的菌丝体产量较高，15天时菌丝体干重可达80mg／个孢子，T19虽然产量低于PDA培养基，但不易污染，适合菌丝体大量培养。该菌对多种碳、氮源及维生素的利用能力相差较大，一定浓度的生物素促进孢子萌发，烟酸、对氨基苯甲酸和泛酸钙抑制孢子萌发，该病菌对腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶的利用能力较低。本研究从国内外收集了小麦矮腥黑穗病菌10个地理种群以及小麦光腥黑粉菌、小麦网腥黑粉菌、小麦散黑穗病菌和玉米丝黑穗病菌等部分近缘种的冬孢子标样。建立了改进的氯化苄DNA提取法，采用液氮冷冻研磨病菌冬孢子，可从病菌10mg冬孢子中成功提取基因组DNA，DNA的质量和数量基本能满足RAPD、RFLP、AFLP等分子生物学研究。采用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，对小麦矮腥黑粉菌和其它近似种rDNA的ITS区进行PCR扩增，结果表明：小麦矮腥黑粉菌和其它近似种均能扩增到一条大小在500～750bp的条带，说明该对引物不能将小麦矮腥黑粉菌同其它近似种区分开。利用EcoRⅠ、PstⅠ和MseⅠ三种限制性内切酶对小麦矮腥黑粉菌及其近缘种的rDNA-ITS区进行酶切，通过RFLP分析，结果表明在供试的10个小麦矮腥黑粉菌地理种群的rDNA-ITS区均能够找到长约250bp的特异片段，而在其它近缘种中未扩增出。将得到的DNA特异性片段进行回收、克隆、序列测定，进一步的工作是根据测序结果设计特定引物对小麦矮腥黑粉菌及其他近似种菌系进行筛选，将获得的稳定、扩增效果好的引物确定成SCAR标记。

论文目录:

摘要

Abstract

1 引言

1.1 小麦矮腥黑穗病的分布和重要性

1.2 小麦矮腥黑穗病发病规律及定殖风险分析

1.3 小麦矮腥黑粉菌检疫技术研究

1.3.1 小麦矮腥黑粉菌形态特征的鉴定研究

1.3.2 小麦矮腥黑粉菌生物学特征的鉴定研究

1.3.3 小麦矮腥黑粉菌分子生物学DNA的鉴定研究

1.4 本项研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验材料

2.1.2 试剂

2.1.3 试剂的配制

2.1.4 仪器

2.2 方法

2.2.1 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件初步研究

2.2.2 小麦矮腥黑粉菌核糖体DNA-ITS区的RFLP研究

2.2.3 多态性片段的回收、克隆与测序

3 结果与分析

3.1 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件初步研究

3.1.1 菌悬液浓度对孢子萌发的影响

3.1.2 培养基对孢子萌发的影响

3.1.3 不同处理的孢子悬浮液对孢子萌发的影响

3.1.4 碳、氮源以及维生素对孢子萌发的影响

3.1.5 液体培养基对菌丝生长的影响

3.2 小麦矮腥黑粉菌核糖体DNA-ITS区的RFLP研究

3.2.1 小麦矮腥黑粉菌基因组DNA的提取

3.2.2 小麦矮腥黑粉菌核糖体DNA(rDNA)ITS区的PCR扩增

3.2.3 小麦矮腥黑粉菌rDNA-ITS区RFLP分析

3.3 多态性片段的回收、克隆与测序

4 结论与讨论

4.1 结论

4.1.1 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件初步研究

4.1.2 小麦矮腥黑粉菌核糖体DNA的多态性分析

4.2 讨论

4.2.1 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发条件初步研究

4.2.2 小麦矮腥黑粉菌核糖体DNA的多态性分析

参考文献

致谢

附录

发布时间: 2007-11-05

参考文献

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