α属冠状病毒S蛋白的变异对其细胞感染特异性的影响

论文摘要

冠状病毒(Coronaviruses, CoV)为有包膜的正链RNA病毒,分为α、β和γ三个属。CoV的RNA基因组发生重组后,相关基因的突变突破种属障碍,实现跨宿主感染。CoV的S蛋白识别细胞受体并介导膜融合,是病毒感染宿主细胞的关键因子。S蛋白S1结构域的受体识别区(Receptor binding domain, RBD)直接参与了受体的识别,该区域的氨基酸变异会导致病毒的种属嗜性和感染特性的变化。由于α属CoV的受体为氨肽酶N(Aminopeptitase N, APN),其氨基酸序列高度保守。因此,S蛋白的变异在很大程度上决定了CoV的种属特异性。本论文选择犬冠状病毒(Canine coroanvirus, CCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和猫冠状病毒(Feline coronavirus, FCoV)三种α属冠状病毒为模型,研究三种病毒在不同宿主来源细胞上的感染特性。并构建嵌合异源S基因的重组病毒,探讨CoV种属间传播的分子机制。首先,用CCoV、FCoV和TGEV分别感染犬A72、猫FCWF和猪ST细胞,通过噬斑实验等方法分析病毒复制与细胞病理变化(Cytopathic effect, CPE)差异。研究发现：三种病毒在其天然宿主来源的细胞上均良好增殖,CPE出现的时间较早,细胞病变明显并且典型,噬斑的大小和形状较一致,病毒滴度峰值出现在感染后12小时左右。在犬A72和猫FCWF细胞上三种病毒的噬斑形态存在差异：TGEV在A72细胞上的适应性不如CCoV和FCoV;CCoV和TGEV对FCWF细胞的病变小于FCoV。在猪ST细胞上,CCoV几乎不引起明显的CPE,而FCoV出现CPE较晚,二者均不能形成明显噬斑和有效增殖。另外,CCoV、FCoV和TGEV均不能在小鼠L2细胞上增殖,同样β属MHV也不能感染A72、FCWF和ST细胞。上述结果说明同属冠状病毒容易突破宿主障碍,但不同属间不容易突破。其次,将CCoV、FCoV和TGEV的S基因分别克隆到载体pMH54中替换MHV的S基因,未能获得重组病毒。但将三个病毒的S基因膜外区替换MHV的S基因膜外区,结果显示相应的重组MHV复制特性与野生型相似。此结果证明α属CoV的细胞感染性差异与S基因膜外区有关,而膜内区可能通过与病毒其它蛋白的作用限制S蛋白装配到病毒粒子上。进一步制备α属CoV的S蛋白N端高变区替代的重组病毒,从而更精确地对决定属内跨宿主感染的S蛋白的氨基酸定位是必要的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 冠状病毒的细胞感染特异性的比较
• 引言
• 材料
• 一、病毒和细胞
• 二、试剂与耗材
• 三、仪器与设备
• 方法
• 一、细胞培养与传代
• 二、病毒感染细胞
• 三、病毒扩增及样品收集
• 四、CPE观察
• 五、噬斑形成试验
• 六、RT-PCR
• 七、琼脂糖凝胶电泳
• 结果
• 一、α属冠状病毒在犬源A72细胞上的增殖特性
• 二、α属冠状病毒在猫源FCWF细胞上的增殖特性
• 三、α属冠状病毒在猪源ST细胞上的增殖特性
• 四、α属冠状病毒对鼠源L2细胞的感染性及与β属鼠肝炎病毒的比较
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 嵌合α属冠状病毒S蛋白重组鼠肝炎病毒构建
• 引言
• 材料
• 一、载体、病毒和细菌
• 二、试剂及耗材
• 三、仪器与设备
• 方法
• 一、RNA抽提、反转录及PCR
• 二、感受态制备
• 三、质粒转化
• 四、质粒抽提
• 五、质粒酶切
• 六、去磷酸化
• 七、琼脂糖凝胶电泳
• 八、胶回收
• 九、DNA片段的连接
• 十、阳性克隆筛选
• 十一、T-A克隆载体制备
• 十二、基因及蛋白序列分析
• 十三、重组病毒制备
• 结果
• 一、CCoV FCoV和TGEV S蛋白及其受体的序列比较分析
• 二、重组载体的构建策略
• 三、重组载体的构建过程
• 四、重组病毒的制备与筛选
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述：冠状病毒跨种属传播的机制
• 摘要
• 一、冠状病毒概述
• 二、冠状病毒的基因重组与跨种属感染
• 三、冠状病毒跨宿主机制的研究
• 1. S蛋白的功能及其变异
• 2. CoV受体的专一性与相对可变性
• 3. S蛋白与受体的识别
• 4. 共感染对跨种属传播的作用
• 四、跨宿主感染的RNA定向重组技术
• 五、小结
• 参考文献
• 论文总结
• 致谢