牛源多杀性巴氏杆菌荚膜和毒力相关基因的克隆及序列分析

论文摘要

随着规模化养殖业的发展和饲养密度的提高,疾病出现混合感染的机会越来越多,许多细菌扮演着继发感染的角色,多杀性巴氏杆菌就是其中一员。2007年,新躺石河子先后有6个规模化奶牛场1-9周龄犊牛突然发病,共有90余头犊牛死亡,通过临床症状以及病原菌的分离鉴定,诊断为多杀性巴氏杆菌引起的犊牛肺炎。为追溯病原,更有效地控制该病的发生,本研究从犊牛肺炎发生牛场采集了健康犊牛鼻腔棉拭,通过对细菌的分离、生化鉴定、药敏实验、动物实验及PCR方法的检测,得到了2株多杀性巴氏杆菌。对所分离得到的多杀性巴氏杆菌以及实验室保存的致犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌荚膜和毒力相关基因hasR、ompH、plpE、ptfA进行克隆测序及序列分析,以便进一步调查致犊牛肺炎巴氏杆菌病的传染源,为研究多杀性巴氏杆菌的致病机理,相关基因的分子特性以及表达奠定基础。结果如下：1、鼻腔棉拭分离的2株生化鉴定结果、分离菌形态特征及培养特性与多杀性巴氏杆菌一致。动物实验表现为24小时内实验小鼠全部死亡,表现很强的致病性,并可以从死亡的小鼠体内分离得到所感染菌,组织染色可明显观察到两极浓染现象。2、参考Townsend发表的多杀性巴氏杆菌种特异性基因引物以及血清型特异性基因引物,以2株分离菌的DNA为模板,通过多重PCR扩增,结果可以扩增出500bp和1000bp左右的两条带,回收后测序并在GenBank中进行Blast比对,显示分别与多杀性巴氏杆菌种特异性基因和荚膜血清A型基因同源性都在99%以上。3、药敏试验表明,健康牛鼻腔棉拭分离得到的2株Pm对新霉素、庆人霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星表现高敏,对氨苄青霉素钠、头孢拉定、卡那霉素、头孢噻呋钠、阿米卡星表现耐受。4、通过对荚膜和毒力相关基因hasR、ompH、plpE、ptfA的序列克隆与分析表明,Pm-BS-d、Pm-BS-a、Pm142-x-4、Pm142-x-3、Pm149-x、Pm149-xby之间同源性为82.2%-100%,这些基因在不同多杀性巴氏杆菌中有着较高的保守性。研究结果证实,致犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌杆菌与健康牛鼻腔棉拭分离的多杀性巴氏杆菌在基因水平上有很高的同源性,这说明致犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌可能就来源于自身呼吸道中本来就存在的多杀性巴氏杆菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 引言
• 文献综述
• 1. 多杀性巴氏杆菌的分类、生物学特性
• 1.1 分类
• 1.2 生物学特性
• 1.3 流行病学特点
• 1.4 多杀性巴氏杆菌致病性
• 1.5 致病机制
• 2. 检测方法研究进展
• 2.1 PCR（Polymerase chain reaction）方法
• 2.2 多杀性巴氏杆菌特性的分子生物学研究方法
• 3. 毒力因子的研究
• 3.1 黏附素相关因子
• 3.2 荚膜蛋白
• 3.3 细胞壁
• 3.4 毒素PMT
• 3.5 铁调节外膜蛋白
• 3.6 外膜蛋白
• 实验一 健康牛源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定
• 1 材料
• 1.1 样本及对照菌株的来源
• 1.2 主要设备、试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 实验动物
• 2 方法
• 2.1 健康牛鼻拭样品的采集
• 2.2 分离、纯化、培养
• 2.3 细菌的鉴定
• 2.4 分离株的PCR快速鉴定
• 2.5 动物致病性试验
• 3 结果与分析
• 3.1 采样的检出结果
• 3.2 病原菌分离培养及培养特性
• 3.3 生化鉴定结果
• 3.4 分离株药敏试验结果
• 3.5 PCR鉴定结果
• 3.6 动物致病性试验结果
• 4 讨论
• 实验二 不同牛源多杀性巴氏杆菌分离株荚膜和毒力相关基因的克隆及序列分析
• 1 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 主要生物试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要缓冲液
• 2 方法
• 2.1 两种牛源多杀性巴氏杆菌基因组DNA的提取
• 2.2 引物及PCR反应体系
• 2.3 PCR产物的回收
• 2.4 感受态细胞的制备
• 2.5 DNA的连接及转化
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 3 结果
• 3.1 目的基因的扩增
• 3.2 重组质粒的PCR鉴定结果
• 3.3 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.4 测序结果及分析
• 4 讨论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表