家蝇抗性等位基因检测与频率分布

论文摘要

家蝇（Musca domestica）是一种在全世界各地分布极为广泛的重要的公共卫生害虫,随着化学杀虫剂的广泛使用,越来越多的家蝇种群产生了抗药性。家蝇是我国病媒生物控制的重点,调查表明中国众多省份的家蝇已对不同的杀虫剂产生了一定程度的抗性,这已经成为对由家蝇传播的疾病控制的一个主要障碍。由于有机磷类（OP）和拟除虫菊酯类农药具有对哺乳动物低毒和对家蝇迅速击倒的特点而得以广泛应用,致使家蝇的抗药性问题已成为人们关注的热点。因此,开展家蝇抗药性监测对于指导合理使用杀虫剂及家蝇综合治理意义重大。本文通过室内生物测定,在探明当前中国各地家蝇对有机磷类和菊酯类杀虫剂的抗性现状的基础上,利用分子生物学技术从基因水平对家蝇kdr抗性特性进行研究,进一步揭示家蝇的击倒抗性机制（kdr）以及建立和改进家蝇抗性的分子检测方法,旨在为有效快速检测害虫抗药性的分子检测方法,延长农药的使用寿命提供理论依据。结果如下：1.2010年测定了上海、北京、广东、吉林、山东、天津等多个省份的家蝇对马拉硫磷、二嗪磷、氯菊酯、溴氰菊酯的敏感性。结果表明,家蝇对马拉硫磷的抗性己达较高水平。抗性最高的为北京天通苑品系（TTY）, LD50值达280.81（219.85-377.51）μg/头,抗性倍数达305倍。所有被检测的品系对二嗪磷均未产生明显抗性,ZYH品系对氯菊酯与溴氰菊酯存在交互抗性。2.用马拉硫磷、二嗪磷、氯菊酯、溴氰菊酯等4种杀虫剂对ZYH品系进行筛选,得到ZYH-M、ZYH-Di、ZYH-P和ZYH-De等4个不同的品系。经过多代筛选后,除ZYH-Di品系外,其它3个品系抗药性皆明显上升。3.用等位基因特异性扩增（AS-PCR）方法扩增出500bp长片段,并用酶切法检测ZYH品系F0代的CYP6D1V1基因型,得到敏感纯合（SS）、杂合（RS）和抗性纯合RR等3种基因型,其频率分别为90.43%、7.45%和2.18%。4.设计合成特异引物并建立等位基因特异性扩增方法（AS-PCR法）,成功检测出ZYH品系中存在6种基因型,分别为L/L、L/F、F/F、L/H、H/H、F/H基因型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 化学农药的应用
• 1.2 昆虫抗药性的产生
• 1.3 家蝇抗药性
• 1.4 家蝇抗性形成机制
• 1.4.1 行为抗性
• 1.4.2 生理抗性
• 1.4.3 代谢抗性
• 1.4.4 靶标抗性
• 1.5 抗药性的检测技术
• 1.5.1 生物测定法
• 1.5.2 区分剂量法
• 1.5.3 生物化学法
• 1.5.4 分子检测法
• 1.6 本研究的目的及意义
• 第二章 中国各地家蝇抗药性调查
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 供试试剂
• 2.1.3 供试虫源及饲养条件
• 2.1.4 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 马拉硫磷的生物测定
• 2.2.2 二嗪磷的生物测定
• 2.2.3 氯菊酯的生物测定
• 2.2.4 溴氰菊酯的生物测定结果及分析
• 2.2.5 PBO增效剂对澳氰菊酯增效结果
• 2.3 讨论与结论
• 第三章 家蝇品系的建立及筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 供试试剂
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论与结论
• 第四章 家蝇抗药性等位基因检测与频率分布
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 供试试剂
• 4.1.3 培养基及各种溶液的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 家蝇基因组DNA的提取
• 4.2.2 家蝇CYP6D1基因扩增及PCR产物纯化
• 4.2.3 连接反应
• 4.2.4 转化反应
• 4.2.5 家蝇CYP6D1v1抗性等位基因型检测
• 4.2.6 家蝇Kdr抗性等位基因突变位点检测
• 4.2.7 家蝇钠离子通道Kdr突变位点检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 家蝇基因组电泳图
• 4.3.2 家蝇CYP6D1基因PCR扩增
• 4.3.3 家蝇CYP6D1v1抗性等位基因检测结果
• 4.3.4 家蝇Kdr抗性等位基因突变位点检测PCR条件的优化
• 4.3.5 家蝇kdr抗性等位基因克隆测序及序列分析
• 4.4 讨论与结论
• 参考文献
• 致谢