张进（上海化学工业区医疗中心上海201507）
【摘要】目的优化用于检测唾液中乙肝表面抗原的ELISA法，并对其进行评价。方法对ELISA的不同条件：样品类型、加样体积和孵育温度及时间进行优化，筛选最佳条件；并采用三种不同的临界值计算方法，判断最佳临界值。结果采用优化后方法，47例血清阳性对应的唾液样品中，44例检测结果为阳性；68例血清阴性对应的唾液样品中，63例检测结果为阴性。血清和唾液样品检测结果的一致性比较高，κ指数为0.87。且该方法的特异度和敏感度分别达到92.6%和93.6%。结论优化后的ELISA方法在唾液样品的乙肝表面抗原检测中具有潜在的应用价值。
【关键词】乙肝病毒表面抗原唾液ELISA
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）27-0108-02
EvaluationofmodifiedELISAmethodtodetectHepatitisBsurfaceantigeninsalivaspecimens
ZHANGJin
(ShanghaiChemicalIndustryParkMedicalCenter,Shanghai200000,China)
Correspondingauthor:ZhangJin,Tel:021-67121616,E-mail:jinzhang1102@sina.com
【Abstract】ObjectiveToevaluatedamodifiedELISAmethodfordetectingtheHepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)insalivasamples.MeyhodsOptimizedthedifferentconditions,includingsampletype,samplevolumeandincubationcondition,toscreenthebestcondition.Threedifferentmethodstocalculatecut-offvaluewasevaluatedtoscreenthemostacceptable.ResultsHBsAgwasdetectedin44salivasamplesoutof47pairedpositiveserumspecimensandnotdetectedin63salivasamplesoutof68matchednegativeserumsamplesbytheoptimizedELISAassay.Therewasexcellentagreementbetweentheresultsfortheserumandsalivaspecimensandthekappavaluewas0.87forsalivaspecimens.Usinganoptimizedprotocol,thesensitivitiesandspecificitieswere93.6%and92.6%,respectively.ConclusionOurdatashowedasignificantpromisefortheuseofthemodifiedcommercialELISAinsalivasampleforHepatitisBvirusinfectionsurveillance.
中国是乙型病毒肝炎的高发国家，根据流行病学调查，人群发生率较高。表面抗原携带率约为15%[1]。乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。目前，中国大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法来检测HBsAg，而检测样品大多数均为血清。静脉抽血取检，受检者痛苦，且操作烦琐，费时费力，存在一定风险，并不利于乙肝疾病长期临床的检验监测。有相关研究报导，唾液中可以检测到乙肝病毒[2]。然而，国内并没有特别针对唾液样品的商品化试剂盒。虽国内有相关研究报导，但方法条件不一，且特异度和敏感度均偏低。因此，本研究以唾液为样品，对ELISA条件进行优化，并对改进后的方法进行评价。
1对象和方法
1.1对象
47例HBsAg血清阳性样本均来自我院住院和门诊患者，其中，男27例，女20例，年龄18～67岁，平均年龄40±12岁。HBsAg血清阴性健康对照68例，均为来我院健康体检人员，其中男36例，女32例，年龄22～56岁，平均年龄38±8岁，无乙肝病毒感染史。所有患者均签署知情同意书。
1.2试剂
购自上海科华公司，均在有效期内使用。
1.3取样
受检者静脉采血2ml，分离血清，存于-20℃待检。同时嘱被检者随机吐唾液3m1，存于-20℃待检。
1.4检测方法
血清检测具体方法严格按上海科华公司提供的说明书进行。唾液检测具体方法除以下几点外，均按说明书进行：1）样品类型：待检的3ml唾液样品，其中1ml直接用于检测，另外2ml离心，取上清用于检测；沉淀部分用2ml蒸馏水重选后用于检测。2）加样体积：50μl；100μl；150μl。3）样品孵育条件：37℃，90min；25℃，18h。
1.5临界值（cut-offvalue,CO）计算
方法1：CO1=阴性对照OD450均值/3
方法2：CO2=阴性对照OD450均值+3SD。
方法3：使用MedCalc统计软件(version9.2.1.0)，利用ROC曲线计算曲线下面积(AUROC)，判断最优临界值CO3。
1.6统计学分析
血清样品的HBsAg检测结果作为评价优化后ELISA方法用于检测唾液样品HBsAg的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值的标准。计量资料采用均数±标准差表示，绝对变量比较采用χ2检验；非绝对变量比较采用Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。唾液和血清检测结果的一致性用κ指数评估。
2结果
阳性血清样品的平均吸光值（OD450）为2.274±1.453,；阴性血清样品的平均吸光值（OD450）为0.017±0.026。三种不同类型的样品检测结果无显著性差异（P=0.100），结果如图1所示。因此，不做任何处理的唾液样品可直接用于检测。不同加样体积检测结果无显著性差异（P=0.070），结果如图2所示。因此，加样体积定为50μl。对样品不同孵育条件（温度、时间）的检测结果（图3）进行分析，结果发现25℃孵育18h的检测结果和对应血清的检测结果极为相似，而与37℃孵育90min的结果差异显著（P=0.003）。
图1不同样品的检测结果。阳性与阴性血清样品的平均吸光值分别为2.274±1.453和0.017±0.026。
Fig.1Resultsofdifferentsampletypes.ODmeanvalueamongpairedpositiveserumsampleswas2.274±1.453andamongnegativeserumsampleswas0.017±0.026.
图2不同加样体积的检测结果。阳性与阴性血清样品的平均吸光值分别为2.274±1.453和0.017±0.026。
Fig.1Resultsofdifferentsamplevolumes.ODmeanvalueamongpairedpositiveserumsampleswas2.274±1.453andamongnegativeserumsampleswas0.017±0.026.
由于目前暂无用于检测唾液中HBsAg的商业化试剂盒，且唾液检测在国内医院中并不常用，所以临界值（cut-offvalue）的计算并没有标准方法。因此，通过对三种不同的临界值计算方法进行评估，结果显示ROC法（CO3）最合适，临界值为0.098。采用该方法后，精确度、阳性预测值和阴性预测值均得到提高，分别达到93.0%、89.9和95.4，结果见表1。
图3不同孵育条件的检测结果。阳性与阴性血清样品的平均吸光值分别为2.274±1.453和0.017±0.026。*P<0.05
Fig.1Resultsofdifferentperiodandtemperatureofsampleincubation.ODmeanvalueamongpairedpositiveserumsampleswas2.274±1.453andamongnegativeserumsampleswas0.017±0.026.*P<0.05
采用ROC曲线法，47例血清阳性对应的唾液样品中，44例检测结果为阳性；68例血清阴性对应的唾液样品中，63例检测结果为阴性（表2）。总之，血清和唾液样品检测结果的一致性比较高，κ指数为0.87。且该方法的特异度和敏感度均达到90%以上，分别为92.6%和93.6%。
表2优化后ELISA法检测唾液中HBsAg结果与对应血清样品结果比较
Table2ResultsofthemodifiedELISAtesttodetectHBsAginsalivasamplesinpairedpositiveandnegativeHBsAgserumspecimens
样品唾液
血清阳性阴性总计
阳性44347
阴性56368
3讨论
唾液用于多种传染病的抗体或抗原检测具有方便性。近年来有大量研究致力于唾液中肝炎病毒标志物检测方法的开发和优化[3,4,5,6]。唾液取样具有简单、快捷、低成本等优点。因此，在部分血清流行病学检测中，唾液取代血清作为检测样品将产生巨大的社会效益和经济效益。本研究主要对ELISA检测唾液中乙肝表面抗原的方法进行了优化和评价。研究中发现，唾液检测结果为阴性的样品，对应的血清检测结果为阳性。可能是由于该唾液样品中HBV抗原浓度太低的原因。同时，我们还发现，该阳性血清样品中HBsAg浓度很高（OD450>3.0），说明血清和唾液中HBsAg浓度并无相关性，原因仍需进一步研究。
由于目前暂无用于检测唾液中HBsAg的商业化试剂盒，且唾液检测在国内医院中并不常用，所以临界值（cut-offvalue）的计算并没有标准方法。三种不同的临界值计算方法在其他研究中均有成功的报导[7,8,9,10,11]。因此，本研究对此三种方法进行评价，结果显示AUROC分析法最为合理，可得到较高的敏感度和特异度。通过对其他条件（样品类型、加样体积、孵育温度和时间）进行优化，最终使该方法的精确度达到93%。
参考文献
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表1不同临界值计算方法的精确度。
Table1Accuracyindicesfordifferentmethodsofcalculationcut-offabsorbanceforHBsAgTestonsalivasample.
PPV:PositivePredictiveValue;
NPV:NegativePredictiveValue;
精确度=(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN);TP:TruePositive;TrueNegative;FalsePositive;FalseNegative.