论文摘要
树突状细胞（Dendritic cell, DC）作为体内功能最强的专职抗原提呈细胞,主要依赖其表面的Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）识别病原微生物,诱导固有免疫（innate immunity）应答,激活特异性免疫应答。Toll样受体7（Toll like receptor 7,TLR7）是近年发现的一类特殊的TLRs,广泛存在于体内免疫细胞中,尤以DC为著。业已证实,TLR7主要作为某些小分子抗病毒化合物和病毒单链RNA（single strand RNA,ssRNA）分子的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRR）,介导DC发挥免疫应答效应。迄今为止,人们对TLR7的亚细胞定位及其识别配体后介导的免疫效应尚不完全清楚。因此,对TLR7的深入研究,将进一步揭示机体抗感染免疫的分子机制。为了解DC中TLR7介导的免疫反应,本课题采用小鼠永生化的树突状细胞系DC2.4为细胞模型,检测了DC2.4中TLR7和TLR4的表达及TLR7识别配体Imiquimod后介导的DC免疫应答效应。本课题的研究内容和实验结果如下:1. DC2.4中TLR7基因和蛋白表达检测根据Gene bank中的小鼠TLR7和β-actin基因全序列,分别设计相应上、下游引物各一对,用反转录PCR（RT-PCR）检测DC2.4中TLR7 mRNA表达,Western blot检测DC2.4中TLR7蛋白表达。结果显示,DC2.4中TLR7只有mRNA转录,检测不到蛋白表达。2. DC2.4中TLR4蛋白表达检测在放有盖玻片的六孔板中,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养DC2.4,待盖玻片上细胞长至约50～60%时,用间接免疫荧光法检测DC2.4中TLR4蛋白表达。结果显示,DC2.4细胞膜表面可检测到TLR4蛋白表达。3. TLR4的配体——LPS刺激DC2.4,诱导TLR7蛋白的表达培养DC2.4至对数生长期,培养液中加入LPS（1 mg/L）,分别在12 h、24 h、48 h、72 h收集细胞,提取蛋白,以未加入LPS组为阴性对照,胎盘组织提取蛋白为阳性对照,用Western blot检测蛋白表达情况。结果表明,LPS刺激DC2.4后12 h,可检测到TLR7蛋白的表达,但72 h后未能检测到。阴性对照组无TLR7蛋白表达,阳性对照组有明显的TLR7蛋白表达。4. TLR7识别配体Imiquimod介导的DC免疫应答效应将DC2.4按1×108 /L接种于96孔板,共分4组,每组均设复孔。设L0组为阴性对照组,L组加入LPS（1 mg/L）,I组加入抗病毒化合物Imiquimod（10 mol/L）,LI组先加入LPS（1 mg/L）,12h后加入Imiquimod（10 mol/L）。培养12h后收获各组细胞培养上清,离心后用ELISA方法检测IL-12和IFN-α表达水平,操作严格按照试剂盒说明书进行。数据采用SPSS11.0软件进行统计处理。结果显示,Imiquimod刺激表达TLR7蛋白的DC2.4后,IL-12分泌显著增加,IFN-α分泌无显著变化。结论:1.在DC2.4中有TLR4蛋白和TLR7 mRNA表达,但检测不到TLR7蛋白表达。2.TLR4天然配体LPS刺激12h后,可诱导DC2.4表达TLR7蛋白,但72h后未能检测到蛋白表达。3.在DC2.4中,诱导表达的TLR7蛋白分子可以识别配体Imiquimod,激活信号转导途径,介导DC分泌免疫因子,IL-12分泌显著增加,而IFN-α分泌无显著变化。