论文摘要
目的：胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤,死亡率居第4位,发病隐匿、进展快、早期出现转移,但治疗手段有限。阐明胰腺癌分子机制是治疗胰腺癌的基础和前提。近年研究提示病毒感染与消化道肿瘤发生发展关系密切,然病毒感染对肿瘤恶性生物学行为影响尚不明了。APOBEC酶作为一种常见的病毒感染反应性蛋白,能使病毒DNA发生超突变,具有广谱抗病毒能力。近来研究提示APOBEC蛋白不仅有抗病毒作用,而且在肿瘤中也有重要功能。本研究目的是通过筛选和鉴定参与肿瘤细胞恶性生物学行为的APOBEC家族成员；检测APOBEC3G（A3G）在胰腺癌中的表达改变；改变A3G表达水平对胰腺癌细胞生物学行为影响的分子机制,以及鉴定其关键作用靶蛋白,从而明确A3G对胰腺癌恶性生物学行为的影响。方法：采用全基因cDNA表达谱芯片筛选参与肿瘤细胞恶性生物学行为的病毒相关蛋白。为探讨A3G在胰腺癌表达情况,采用Real-time PCR检测3株胰腺癌细胞系,11例配对胰腺癌及癌旁组织中A3G mRNA水平；采用免疫组化和免疫荧光进一步验证54例配对胰腺癌病理组织切片中A3G蛋白的表达情况。为评价A3G在胰腺癌中的作用,建立了稳定表达A3G的胰腺癌细胞系,并观察过表达A3G对裸鼠皮下移植瘤形成情况的影响。为研究A3G早期促进成瘤的分子机制,采用克隆球形成试验、失巢凋亡（anoikis）实验和流式检测早期凋亡水平,并用western blot检测凋亡相关蛋白表达情况。为进一步研究A3G抑制anoikis的分子机制,我们检测了Akt通路活性,western blot检测了Akt通路中关键抑制蛋白PTEN的表达,并用免疫共沉淀方法检测A3G与PTEN的相互作用。同时采用荧光素酶双报告基因方法检测了Wnt通路活性,用免疫共沉淀筛选作用于Wnt通路的关键蛋白。我们进一步构建各种结构域突变体分析A3G与PTEN、FZD蛋白的结合位点。结果：基因芯片筛选发现病毒感染反应性蛋白A3G可能参与肿瘤恶性生物学行为；A3G在胰腺癌细胞和组织中表达升高；高表达A3G早期可促进动物移植瘤的成瘤,晚期又能抑制肿瘤生长；体外研究发现A3G增加了抗凋亡蛋白Bcl-2, Mcl-1和phospho-Bcl-2的表达,显著抑制胰腺癌细胞的anoikis;进一步发现过表达A3G是通过激活Akt激酶活性从而参与anoikis抵抗,A3G激活Akt通路是通过灭活PTEN蛋白活性实现的,A3G与PTEN结合需要A3G的CD2结构域存在,PTEN与A3G结合需要PTEN的C2结构域和PDZ结构域的存在。我们还发现A3G通过与FZD1蛋白结合参与调控Wnt通路,A3G与FZD1结合与A3G磷酸化水平相关,与结构域无明显相关性；FZD1与A3G结合需要两个结构域均存在。结论：病毒感染反应性蛋白A3G在胰腺癌中表达升高,可能通过灭活PTEN介导的Akt通路激活导致anoikis抵抗,通过FZD参与调控Wnt通路活性,提示A3G除抗病毒作用外还参与了肿瘤恶性生物学行为的调控。