HMGB1在类风湿关节炎中的致病机制及三氧化二砷干预作用的研究

论文摘要

目的:类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种常见的自身免疫性疾病,其病因和发病机制尚不完全清楚,又缺乏特异性的治疗措施,50%的患者12年出现骨质破坏,多数患者出现不同程度的关节功能障碍和畸形,平均寿命缩短1015年,该病已经成为我国劳动力丧失的主要原因之一。因此探讨RA的发病机制、寻找有效的治疗措施,对于改善患者生存质量,具有十分重要的意义。RA最基本的病理改变是滑膜炎,即滑膜组织异常增生并向软骨和骨组织浸润从而导致骨质破坏和关节畸形。大量研究表明,众多细胞因子在RA慢性滑膜炎的病理机制中起着核心作用。高迁移率族蛋白1 （ high mobility group box chromosomal protein 1, HMGB 1）是近年来发现的一种新型细胞因子,胞外HMGB1具有促进炎细胞趋化、肿瘤细胞和血管增殖的作用,在感染和非感染性炎症、组织损伤、肿瘤的生长和转移等方面起着重要作用。但其在RA滑膜组织增殖中的致病机制并不清楚。RA滑膜组织增生的病理学行为酷似肿瘤组织的特性,因此,在常规治疗方案中应用的多种药物如:甲氨喋呤、环磷酰胺等免疫抑制剂都借鉴于肿瘤的研究成果。三氧化二砷（Arsenic trioxide, ATO）作为传统中药的有效成分,已广泛应用于白血病等恶性肿瘤的治疗,因其具有显著抑制多种细胞增殖、促进凋亡的作用。近期研究表明,ATO具有极强的免疫抑制作用,它能够通过抑制淋巴细胞分化、巨噬细胞的趋化和吞噬作用影响正常免疫功能。因此推测ATO对RA具有治疗作用。本试验从临床病例资料、动物试验和细胞培养三个方面,采用多种实验技术研究HMGB1在滑膜炎中的作用及信号转导机制,并观察ATO对滑膜组织增殖和大鼠类纤维母细胞样滑膜细胞株RSC-364生长的抑制作用,通过观察JAK/STAT信号转导基因表达的变化,探讨ATO在RA治疗中可能的作用机制,为RA治疗提供新的治疗策略和实验依据。方法:1 HMGB1蛋白和mRNA在类风湿关节炎患者外周血中的表达及意义选取河北医科大学第二医院免疫风湿科门诊及住院RA患者40例,均符合1987年美国风湿病学会诊断标准,其中活动期RA患者20例,非活动期RA患者20例。另搜集与其性别年龄相匹配的健康志愿者12例为健康对照组。所有入组人群均无吸烟史及合并肿瘤和感染性疾病。采用ELISA方法检测血清中HMGB1的浓度;RT-PCR检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中HMGB 1 mRNA的表达;流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）在PBMC中的表达变化。同时记录相应的临床和实验室指标及关节X线分期。2 HMGB1在胶原诱导的关节炎大鼠滑膜组织增殖中的作用将30只雄性Wistar大鼠随机分成4组,分别为正常对照I组和正常对照II组（每组6只）、模型I组和模型II组（每组9只）。模型组采用II型胶原乳剂建立胶原诱导的关节炎（Collagen-induced arthritis, CIA）大鼠模型。每周2次记录大鼠的全身状态并进行关节肿胀评分。分别于第28天和第49天通过股动脉取血处死正常对照组和相应模型组中已成模的大鼠并取材。H.E染色观察大鼠关节组织病理学改变;免疫组织化学检测关节组织中HMGB1、PCNA的表达;FCM检测关节组织中HMGB1、PCNA、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、SOCS1、SOCS3蛋白的表达。3 HMGB1诱导大鼠RSC-364细胞增殖的作用机制取处于对数生长期的大鼠RSC-364细胞,用2.5g.L-1胰蛋白酶消化,按1×104个孔-1接种于6孔板和100mL的培养瓶中,待细胞贴壁24h后,轻轻吸去上清,加入含10μg.L-1重组人HMGB1的培养基刺激细胞,同时设不含药物的阴性对照组和等体积的生理盐水溶剂对照组,每时间点重复设6组。于孵育6h、12h、24h后收集细胞,RT-PCR检测p-STAT1/3 mRNA的表达变化;FCM检测HMGB1诱导的RSC-364细胞周期分布变化和PCNA、Cyclin D1、CDK4、p-STAT1 /3、SOCS 1 / 3蛋白表达的变化;免疫细胞化学检测HMGB1对RSC-364细胞PCNA、P21、p-STAT1/3、SOCS1/3蛋白表达的影响。4 ATO对RA滑膜细胞增殖的抑制作用和机制（1）ATO对HMGB1诱导的RSC-364细胞增殖的影响取对数生长期的RSC-364细胞,用含有10μg.L-1 HMGB1加不同浓度（0、5、10、20、40和80μmol.L-1）ATO的培养基进行干预,同时设不含药物的阴性对照组和等体积的生理盐水溶剂对照组。孵育6、12及24h后,采用MTT法检测ATO对RSC-364细胞生长的抑制作用。根据MTT的结果,将常规培养的RSC-364细胞分为正常对照组、HMGB1组和HMGB1加不同浓度（10、20和40μmol. L-1）ATO处理组,培养24h后,收集细胞;采用FCM检测ATO对细胞周期分布和CyclinD1、CDK4、p-STAT1蛋白的表达量的影响;免疫细胞化学检测ATO对RSC-364细胞P21、p-STAT1蛋白表达的影响;RT-PCR检测ATO对p-STAT1 mRNA的表达的影响。（2）ATO对CIA大鼠滑膜组织增殖的抑制作用将42只雄性Wistar大鼠随机分成五组,I组6只, IIV组用于制备CIA模型,每组9只。于初次免疫后第22天,随机抽取IIV组中关节炎指数评分大于2分的大鼠各6只。I组为正常对照组,II组为模型对照组,分别给予等体积的生理盐水,IIIV组为低、中、高剂量ATO治疗组,分别给予1.0,2.0和4.0 mg.kg-1.d-1的ATO。采用腹腔注射给药方法,连续给药28天后,股动脉取血处死所有大鼠并取材。H.E染色观察大鼠关节组织病理学改变;FCM检测HMGB1、PCNA、p-STAT1、SOCS1蛋白的表达变化;免疫组织化学检测HMGB1、PCNA的表达变化。结果:1 HMGB1蛋白和mRNA在RA患者外周血中的表达变化及意义（1）不同组人群血清和PBMC中HMGB1蛋白及mRNA的表达水平变化活动期RA患者血清中HMGB1蛋白的水平显著高于健康对照组和非活动期RA组[（10.60±1.29 vs 8.39±1.53,8.10±2.38）ng.mL-1] （P<0.01）;非活动期RA组和健康对照组之间差异无统计学意义。RT-PCR结果表明:在不同组别之间,HMGB1mRNA相对表达量与血清中HMGB1蛋白的水平变化一致。（2）TLR4在不同组人群PBMC中的表达变化流式细胞术分析显示,活动期患者CD14+TLR4+单核细胞高于非活动期和健康对照组,且差异有统计学意义。外周血淋巴细胞表面TLR4阳性表达率在三组间差异均无统计学意义。（3）相关性分析:RA患者血清中HMGB 1蛋白表达水平与ESR、CRP、关节压痛数、关节肿胀数呈正相关,但与年龄、病程、RF及X线分期均无相关性。2 HMGB1对CIA大鼠滑膜组织增殖的影响（1）大鼠关节组织形态学改变正常对照组中大鼠关节腔滑膜结构清晰,滑膜、关节软骨及骨组织无异常形态学改变。模型组中大鼠滑膜细胞增生肿胀,呈圆形、椭圆形或多角形,滑膜细胞层次增多,排列紊乱;毛细血管增生,可见炎细胞浸润。随着病变加重,增生的滑膜组织呈绒毛状,形成血管翳,伸向关节腔深处或向软骨表面爬行,软骨间质水肿,软骨细胞排列紊乱,细胞肿胀、变性,表层组织可见变性、坏死、甚至剥脱,骨质侵蚀及破坏。（2）关节组织中HMGB1蛋白的表达变化免疫组织化学显示:正常大鼠滑膜中HMGB1蛋白位于滑膜细胞的细胞核,细胞浆中多为阴性表达,软骨细胞的细胞核和细胞浆均为阳性表达。随着关节炎发生、发展,HMGB1蛋白在滑膜细胞、血管内皮细胞及部分炎性细胞表达增加,阳性表达不仅局限于细胞核,细胞胞浆和细胞外基质中也呈现大量阳性颗粒;破损软骨表面附有大量HMGB1蛋白阳性细胞,在骨髓腔中大量细胞的胞核和胞浆均表达HMGB1蛋白。FCM结果显示:随着关节炎加重,HMGB1蛋白表达显著增加。（3）关节组织中PCNA蛋白的表达变化免疫组织化学显示:阳性颗粒位于滑膜细胞的胞核内,软骨细胞、血管内皮细胞均呈阴性表达;随着关节炎加重,滑膜细胞阳性表达增加,增生的血管内皮细胞和浸润的炎细胞胞核内可见阳性颗粒;大量PCNA蛋白表达阳性的滑膜细胞覆盖于软骨表面,并向软骨下侵蚀。FCM定量结果显示:随着关节炎加重,PCNA蛋白表达显著增强。（4）关节组织中p-JAK2、p-STAT1 / SOCS1、p-STAT3 / SOCS3蛋白的表达变化FCM定量结果显示:在关节炎早期,p-JAK2蛋白表达一过性增加（P<0.05）,但随着关节病变加重,p-JAK2蛋白表达迅速回落。与正常对照组相比,模型组中p-STAT1/SOCS1及p-STAT3 / SOCS3蛋白表达量均显著增加（P<0.01）;但随着病程延长,SOCS1蛋白表达较早期组明显减少（P<0.01）, p-STAT1、p-STAT3 / SOCS3蛋白表达变化无显著性意义。（5）相关分析: HMGB1、p-STAT1、p-STAT3与PCNA的表达呈显著正相关（r =0.638, P=0.000;r =0.529, P=0.005;r =0.670, P=0.000）。HMGB1与p-STAT1、p-STAT3的表达呈正相关（r =0.474, P=0.014;r =0.480, P=0.013）。HMGB1与p-JAK2无相关性（r =0.222, P=0.276）。3 HMGB1促进大鼠RSC364滑膜细胞增殖的作用机制（1）HMGB1对大鼠RSC364滑膜细胞增殖的影响HMGB1刺激6 h时,细胞周期及增殖指数均没有明显的改变,但随着作用时间的延长,处于G0/G1期的细胞逐渐减少,G2/M期细胞增多,增殖指数升高（P<0.05或0.01）。免疫细胞化学结果显示,PCNA和P21蛋白阳性信号均表达于滑膜细胞核内,随着作用时间延长,PCNA蛋白表达增强,阳性细胞数目逐渐增多;而P21蛋白表达减低,阳性细胞数目逐渐下降。FCM定量结果显示:HMGB1呈时间依赖性上调PCNA及Cyclin D1蛋白表达（P<0.01）;HMGB1能够上调CDK4蛋白表达（P<0.01）,但随着刺激时间的延长,其表达量无明显变化。（2）HMGB1对RSC-364细胞STAT/SOCS信号通路的影响RT-PCR、免疫细胞化学和FCM定量结果均显示:HMGB1均呈时间依赖性上调STAT1 mRNA和蛋白的表达,24h表达最高（P< 0.01）。免疫细胞化学显示:SOCS1蛋白阳性信号表达在细胞浆和/或细胞核,HMGB1作用6h至12h,SOCS1表达明显增强,24h时SOCS1表达减弱,阳性细胞数目减少;FCM定量结果也显示SOCS1蛋白的表达呈先增高后下降的趋势。RT-PCR、免疫细胞化学和FCM定量结果均显示:HMGB1作用6 h24h,对STAT3 mRNA和蛋白的表达没有明显影响;而作用6h后,SOCS3蛋白阳性信号主要表达于细胞浆,少数细胞胞核内呈现阳性,显著高于正常对照组,但随着时间的延长,其表达下降,24h阳性的细胞数目明显减少。FCM定量亦显示,HMGB1刺激6h SOCS3蛋白表达呈现一过性升高,12h和24h其表达量很快下降,接近正常水平。（3）相关分析:Cyclin D1、CDK4、p-STAT1蛋白表达与PCNA的表达呈显著正相关（r =0.717, P=0; r =0.514, P=0.001和r =0.621, P=0）,Cyclin D1、p-STAT1蛋白的表达与增殖指数呈显著正相关（r =0.815,P=0.001和r =0.424, P=0.010）。p-STAT3蛋白表达与PCNA的表达无相关性（r =0.244, P=0.151）。4 ATO对RA滑膜细胞增殖的抑制作用及机制（1）ATO对HMGB1诱导的RSC-364细胞增殖的影响及机制MTT结果显示:ATO对HMGB1诱导的滑膜细胞生长的抑制作用呈时间和浓度依赖性,在6h时就能够抑制HMGB1引起的细胞增殖;80μmol.L-1 ATO作用24h抑制率可达88.18%。FCM结果表明:ATO作用24h,处于G0/G1期的细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,PI下降,并呈浓度依赖性。ATO可明显抑制HMGB1诱导的cyclin D1和CDK4蛋白表达;显著上调P21蛋白的表达,并呈浓度依赖性。同时ATO可显著抑制p-STAT1 mRNA和蛋白的表达,作用24 h后,随着药物浓度的升高其表达量逐渐减少。（2）ATO对CIA大鼠滑膜组织增殖的抑制作用ATO治疗大鼠全身反应较模型组减轻,关节红肿程度减轻,关节炎指数亦较模型组下降。光镜下显示:随着治疗剂量的增加,滑膜细胞增生明显减轻,仍排列较紊乱,组织充血水肿逐渐减轻,增生的血管和浸润的炎细胞数量逐渐减少,血管翳少见。软骨表面仍不光滑,但表层组织的变性、坏死减轻。免疫细胞化学显示:ATO治疗后,滑膜细胞核、细胞质和胞外基质中HMGB1阳性颗粒,随治疗剂量增加逐渐减少,4mg.kg-1. d-1组尤为显著;PCNA蛋白阳性的细胞数目也明显减少。FCM定量结果显示: ATO治疗后,HMGB1和PCNA蛋白表达量呈药物浓度依赖性下降。与模型组相比,低、中剂量ATO治疗4W,p-STAT1蛋白表达明显减低（P<0.01和P<0.05）,而高剂量组没有明显的变化。不同剂量ATO对SOCS1蛋白表达无明显影响。（3）相关性分析:不同浓度的ATO处理HMGB1诱导的大鼠RSC-364细胞24 h时,p-STAT1蛋白表达与Cyclin D1、CDK4的表达呈显著正相关（r =0.854或r =0.681, P=0）,p-STAT1、Cyclin D1、CDK4蛋白的表达与PI呈正相关（r =0.833,P=0;r =0.735, P=0和r =0.414, P=0.023）。低、中剂量的ATO治疗CIA大鼠4W时,HMGB1、p-STAT1蛋白表达与PCNA表达呈正相关（r =0.425,P=0.038;r =0.413, P=0.045）;高剂量治疗4W时,HMGB1、p-STAT1蛋白表达与PCNA表达无相关性（r =0.334,P=0.071;r =0.252, P=0.179）。结论:1活动期RA患者PBMC能够主动合成、分泌HMGB1,使患者血清中表达水平明显升高;通过自分泌作用,HMGB1与CD14+的单核细胞表面TLR4+结合激活PBMC,介导炎症反应,促进RA病情进展;血清中HMGBl的水平与ESR、CRP、关节压痛数、关节肿胀数呈正相关,因此,HMGBl可作为判断RA患者病情活动的实验室指标之一。2 HMGB1可能通过上调STAT1/SOCS1和STAT3/SOCS3信号转导蛋白的表达介导类风湿性关节炎发病过程中滑膜细胞增生、关节骨质吸收和破坏的病理过程。3晚期炎症介质HMGB1可能通过激活STAT1/SOCS1信号转导途径,促进Cyclin D1/CDK4基因过度表达,下调P21表达,推动细胞周期进程,导致了滑膜细胞过度增殖。4 ATO可通过部分抑制STAT1信号转导过程,下调CyclinD1和CDK4表达,并上调细胞周期抑制性蛋白P21的表达,阻止细胞周期进程,抑制HMGB1引起的滑膜细胞增殖。本实验从临床病例资料、动物试验和细胞培养三个方面进行研究,首次探讨了HMGB1介导的JAK/STAT/SOCS信号通路在RA滑膜细胞增殖中的作用,结果显示,HMGB1可以通过激活JAK/STAT/SOCS信号途径上调细胞周期蛋白的表达,促进滑膜细胞增殖;并首次揭示ATO抑制滑膜细胞增殖的机制可能与减少HMGB1的表达及阻断STAT1信号转导有关。该实验对开展RA的分子靶向治疗具有重要的价值。但是ATO是一种剧毒物质,本研究仅就其在动物性关节炎中的作用进行了初步探讨,对RA的治疗机制有待进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 HMG81 在类风湿关节炎中的致病机制及三氧化二砷干预作用的研究
• 引言
• 第一部分 HMG81 在类风湿关节炎患者外周血中的表达及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 HMG81 在CIA 大鼠滑膜组织增殖中的作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 HMG81 诱导大鼠RSC364 滑膜细胞增殖的作用机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 三氧化二砷对RA 滑膜细胞增殖的抑制作用及机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢
• 个人简历