论文摘要
血管平滑肌细胞（VSMC）表型转化是动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的共同病理生理特征。其中,VSMC表型转化过程中,表型标志基因的表达变化和细胞骨架的重构是当前国内外学者研究的热点问题之一。平滑肌22α（SM22α）是近年来发现的一种VSMC分化标志物,其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性,该蛋白与细胞骨架聚合有关。为了确定SM22α是否与细胞骨架蛋白肌动蛋白（actin）存在相互作用和其所依赖的结构域,以及二者之间的结合在VSMC骨架重构和表型转化过程中的病理生理学意义,本研究通过重组表达GST-SM22α融合蛋白及缺失ABS1和CLR结构域的GST-SM22α（1-151）融合蛋白,来观察SM22α和SM22α（1-151）在不同表型VSMC中与骨架聚合和细胞收缩之间的关系。1 pGEX4T-SM22α和pGEX4T-SM22α（1-151）的构建与鉴定分别构建GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白表达质粒,重组质粒经PCR扩增和EcoR I/Xho I双酶切鉴定后,命名为pGEX4T-SM22α和pGEX4T-SM22α（1-151）。2 GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白的诱导表达pGEX4T-SM22α和pGEX4T-SM22α（1-151）宿主菌经IPTG诱导后可表达预期分子量的GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白,该融合蛋白以胞浆可溶性蛋白和包含体两种形式存在。诱导条件为培养物（OD600=1.5）按1:50接种于含0.5 mM IPTG的LB培养液中,30℃振荡培养6 h。3 GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白的分离纯化细菌裂解液上清直接经GST亲和层析进行纯化后,每100 ml培养物可得到约20 mg电泳纯的可溶性GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白。4离子强度对SM22α与actin结合活性的影响分别用含25 mM、50 mM、100 mM和150 mM KCl的结合缓冲液进行GST pull down分析实验和F-actin体外聚合实验。GST pull down分析结果显示,随着KCl浓度的增高,结合有GST-SM22α的Sepharose 4B亲和介质上结合的actin量逐渐减少。F-actin体外聚合实验亦显示,聚合缓冲液中KCl浓度越高,交联沉淀的F-actin越少,证明SM22α与actin的结合活性受KCl浓度的影响,二者的结合活性随着KCl浓度的升高而减小。5 SM22α与actin的相互作用依赖于ABS1和CLR结构域用结合有SM22α和SM22α（1-151）的GST Sepharose 4B为亲和介质对VSMC F-actin组分蛋白进行淘选,Western blot分析表明,从结合有SM22α的亲和介质中可以检测到actin的存在,而且在收缩型VSMC中亲和得到的actin明显多于合成型VSMC,但是结合有SM22α（1-151）的亲和介质中没有检测到actin,说明SM22α是通过ABS1和CLR结构域与F-actin相互作用的。将GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）蛋白纯品与F-actin共孵育,用SDS-PAGE可从孵育后离心得到的沉淀物中检测到交联的F-actin ,而加入GST-SM22α（1-151）的孵育物中未得到沉淀的交联F-actin,表明SM22α可通过其ABS1和CLR结构域促进F-actin发生体外交联。以上结果表明,SM22α通过ABS1和CLR结构域与F-actin相互作用,从而参与VSMC表型转化过程中actin的聚合和交联。结论1成功构建了GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白大肠杆菌表达系统,获得电泳纯的GST-SM22α和GST-SM22α（1-151）融合蛋白,每100 ml培养物可得到约20 mg电泳纯的可溶性融合蛋白。2证实KCl的浓度对SM22α与actin的结合活性有影响,随着KCl浓度的升高二者相互作用的能力减小。3证实SM22α是通过ABS1和CLR结构域与actin相互作用,促进actin聚合与交联。