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大豆两个MYB转录因子基因的克隆及其功能分析

2020-12-11阅读(736)

大豆两个MYB转录因子基因的克隆及其功能分析

论文摘要

大豆不仅可提供优质丰富的蛋白质和油脂,更是具有多种生物活性的异黄酮类化合物的重要来源。异黄酮被认为在植物-微生物互作系统中发挥着多种多样的作用,在人类的营养及健康方面也具有重大的潜力。大豆异黄酮是一类次级代谢产物,它们是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成的,这个途径在整个植物界普遍存在。研究发现,大多数MYB转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作用。MYB是植物中数量最多,功能最多样化的一类转录因子,参与对植物次生代谢的调控、激素和环境因子的应答,并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片等器官的形态建成具有重要的调节作用。因此,对大豆MYB转录因子进行研究,明确其在大豆类黄酮代谢中的地位和作用,阐明其功能,将有助于揭示大豆异黄酮的调控机理。本研究利用PCR技术首次从大豆品种吉林32中克隆了一个新的MYB基因（基因银行注册号码为JF510467）,命名为GmMYB12B2,同时克隆了GmMYB12a基因,并对它们的功能做了初步分析。主要研究结果如下：1.利用RT-PCR技术从大豆品种（吉林32）中首次克隆了GmMYB12B2基因,全长783bp,编码260个氨基酸；通过氨基酸序列比对分析发现,它含有两个MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB转录因子。同时克隆了GmMYB12a基因。2.构建GmMYB12a与GmMYB12B2基因的原核表达载体pET-28a-GmMYB12a及pET-28a-GmMYB12B2,分别转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中,在28℃、1.2 mMIPTG诱导6h后,可以获得纯度较高的目的蛋白。3.利用半定量RT-PCR分析了GmMYB12a与GmMYB12B2基因对各种胁迫的应答情况。结果显示,在紫外辐射、高盐胁迫下,随着处理时间的延长,两基因的表达量逐渐增加,而GmMYB12B2的表达量升高的较GmMYB12a显著。两基因对低温、干旱、ABA响应不明显。4.构建酵母效应质粒pGBK7-GmMYB12a及pGBK7-GmMYB12B2,转入酵母菌株AH109中,在营养缺陷型培养基SD/-Trp/-Ade/-His+3-AT上筛选阳性转化子。酵母表达结果显示,GmMYB12B2具有明显的转录激活活性,β-半乳糖苷酶显色反应呈现出明显的蓝色；转入GmMYB12a的酵母菌不能在营养缺陷型培养基上生长,表明其不具转录激活功能或具有极微弱的转录激活活性。5.构建绿色荧光蛋白融合表达载体pBI121-GFP-GmMYB12a及pBI121-GFP-GmMYB12B2,农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明,两基因均定位于细胞核中,与亚细胞定位预测一致。6.利用定量PCR技术对GmMYB12a与GmMYB12B2基因的组织特异性表达情况进行了检测,结果表明,GmMYB12B2在根及成熟的种子中表达量较高,随着种子逐渐发育成熟,其表达量也随之升高；GmMYB12a与GmMYB12B2的表达模式基本一致,只是其表达量相对较低。7.利用HPLC法测定了大豆不同组织中异黄酮的含量,结果表明,大豆各组织的异黄酮含量情况为：大豆籽粒>60d胚>50d胚>40d胚>花>荚>20d胚>30d胚>叶>根>茎。未成熟胚中大豆异黄酮的积累基本符合随着成长天数的增加而增加的规律,只是在30天胚中有所下降,这一积累规律与GmMYB12a和GmMYB12B2基因在这些时期的表达规律基本一致。8.构建植物表达载体pCAMBIA1301-CHS8P、PPZP-GmMYB 12a及PPZP-GmMYB12B2,按照不同组合在大豆愈伤组织中进行瞬时表达。CHS8是植物类黄酮合成途径中的关键酶,通过分析MYB转录因子是否与其相互作用可以鉴定MYB是否参与了类黄酮的生物合成。实验结果表明,共侵染pCAMBIA1301-CHS8P与PPZP-GmMYB 12B2质粒载体的大豆愈伤组织的GUS荧光值最高。这就表明,转入GmMYB12B2基因确实对CHS8基因有调控作用,使共转化的大豆愈伤组织GUS荧光活性升高。GmMYB12a的作用不明显。9.构建植物表达载体PPZP-GmMYB 12a及PPZP-GmMYB 12B2,利用农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥T3代植株中类黄酮合成途径中各关键酶的表达情况进行检测,结果表明：在转GmMYB12B2的株系中,PALI、CHS、FLS的表达明显较野生型及转入空载体的拟南芥株系的表达量要高,而CHL、F3H、F3’H的表达在各株系中变化不明显,DFR的表达量在转GmMYB12B2的株系中稍有下降。GmMYB12a与GmMYB12B2的表达模式基本一致,只是其表达量相对较低。这说明GmMYB12B2与GmMYB12a均可调控植物的类黄酮的生物合成。对转基因拟南芥的抗性分析显示,两基因均可提高转基因拟南芥的盐及紫外辐射耐受能力,只是GmMYB12a的作用较GmMYB12B2弱。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 中英文缩略语表
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 植物MYB转录因子研究
  • 1.1.1 植物MYB转录因子的特征与分类
  • 1.1.2 植物MYB转录因子的起源与进化
  • 1.1.3 植物MYB转录因子的功能
  • 1.2 大豆中的MYB转录因子
  • 1.3 植物转录因子功能研究方法
  • 1.3.1 植物转录因子瞬间表达法
  • 1.3.2 突变体或转基因植株功能分析
  • 1.4 大豆异黄酮的研究
  • 1.4.1 大豆异黄酮的种类与分布
  • 1.4.2 异黄酮的生物合成及其关键酶基因
  • 1.4.3 异黄酮生物合成途径的调控
  • 1.4.4 异黄酮的生理功能
  • 1.5 本研究的目的与意义
  • 第二章 大豆两个MYB转录因子的克隆及序列分析
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 植物材料及菌株
  • 2.1.2 工具酶及生化试剂
  • 2.1.3 主要仪器设备
  • 2.1.4 PCR引物
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 大豆总RNA的提取
  • 2.2.2 第一链cDNA的合成
  • 2.2.3 大豆两个MYB基因cDNA全长PCR扩增
  • 2.2.4 PCR产物回收
  • 2.2.5 PCR产物的克隆
  • 2.2.6 大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备及转化
  • 2.2.7 转化子的蓝、白斑筛选
  • 2.2.8 转化子的鉴定
  • 2.2.9 大豆两个MYB基因的序列分析
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 大豆两个MYB基因cDNA全长序列的获得
  • 2.3.2 两个MYB基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测
  • 2.4 讨论
  • 2.5 小结
  • 第三章 GmMYB12a与GmMYB12B2功能的初步分析
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 植物材料
  • 3.1.2 菌株及质粒
  • 3.1.3 工具酶及生化试剂
  • 3.1.4 主要仪器设备
  • 3.1.5 PCR引物
  • 3.1.6 实验中用到的培养基及药品配制
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 表达载体的构建
  • 3.2.2 重组蛋白在宿主菌Rosetta（DE3）中的诱导表达及鉴定
  • 3.2.3 酵母感受态细胞的制备及转化
  • 3.2.4 β-半乳糖苷酶活性滤纸分析
  • 3.2.5 农杆菌感受态细胞的制备及转化
  • 3.2.6 农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞
  • 3.2.7 半定量RT-PCR方法分析两基因对不同胁迫的应答
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 表达载体的构建
  • 3.3.2 GmMYB12a与GmMYB12B2在大肠杆菌中的高效表达
  • 3.3.3 GmMYBl2a与GmMYB12B2的转录激活活性验证
  • 3.3.4 GmMYB12a与GmMYB12B2的亚细胞定位
  • 3.3.5 GmMYB12a与GmMYB12B2对不同胁迫的应答
  • 3.4 讨论
  • 3.5 小结
  • 第四章 GmMYB12a和GmMYB12B2与异黄酮合成途径的关系
  • 4.1 材料
  • 4.1.1 植物材料及质粒
  • 4.1.2 工具酶及生化试剂
  • 4.1.3 主要仪器设备
  • 4.1.4 PCR引物
  • 4.2 方法
  • 4.2.1 大豆不同组织总RNA的提取及反转录
  • 4.2.2 Real Time PCR分析两基因的组织表达特性
  • 4.2.3 大豆不同组织异黄酮的提取
  • 4.2.4 HPLC法测定大豆不同组织的异黄酮含量
  • 4.2.5 CHS8P植物表达载体的构建及转化农杆菌
  • 4.2.6 农杆菌介导法侵染大豆愈伤组织
  • 4.2.7 GUS组织化学染色
  • 4.2.8 GUS荧光测定
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 GmMB12a与GmMYB12B2在大豆不同组织的表达
  • 4.3.2 大豆不同组织异黄酮含量分析
  • 4.3.3 CHS8P植物表达载体的构建及转化农杆菌
  • 4.3.4 各表达载体在大豆愈伤组织的瞬时表达分析
  • 4.4 讨论
  • 4.5 小结
  • 第五章 GmMYB12a与GmMYB12B2在拟南芥中的表达及其相关功能分析
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 植物材料
  • 5.1.2 菌株及质粒
  • 5.1.3 工具酶及生化试剂
  • 5.1.4 主要仪器设备
  • 5.1.5 PCR引物
  • 5.1.6 实验中用到的培养基及药品配制
  • 5.2 方法
  • 5.2.1 植物表达载体的构建
  • 5.2.2 植物表达载体转化农杆菌及鉴定
  • 5.2.3 GmMYB12a与GmMYB12B2向拟南芥中的转化
  • 5.2.4 转基因拟南芥的筛选及鉴定
  • 5.2.5 转基因拟南芥T3代类黄酮合成途径中各关键酶的表达
  • 5.2.6 转基因拟南芥T3代的抗性分析
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 植物表达载体的构建
  • 5.3.2 植物表达载体转化农杆菌及鉴定
  • 5.3.3 转基因拟南芥植株的筛选及检测
  • 5.3.4 转基因拟南芥T3代类黄酮合成途径中各关键酶的表达
  • 5.3.5 转基因拟南芥T3代的抗性分析结果
  • 5.4 讨论
  • 5.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 作者简介
  • 攻博期间发表的学术论文及其他成果
  • 导师简介
  • 致谢

    • 相关论文文献

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