论文摘要
前言肝脏移植（liver transplantation,LT）目前已经成为治疗终末期肝病的唯一有效方法,多年来的研究重点一直是如何控制排斥反应和最终获得免疫耐受,却忽略了移植物抗宿主疾病（graft versus host disease,GVHD）的临床意义和研究。自1988年Burdick等报道了全球第一例肝脏移植后急性移植物抗宿主疾病（aGVHD following liver transplantation/liver transplantation associated aGVHD,LTx-aGVHD）以来,相关报道逐渐增多,今已达约80例。根据国际上几个著名肝脏移植中心统计报道,其发病率虽然为1—2%,因LTx-aGVHD无特异性临床症状、对其发生发展机制认识不足和缺乏有效的诊断治疗手段,发病后死亡率高达80%—100%,故已引起了肝脏移植领域专家们的重视。有限的病例数量、难以预计的发病限制了临床进行系统和深入的研究,目前对本病研究仍主要停留在临床病例的报道及总结上,对其发生机制、病理生理变化的理解也多是从对骨髓移植后aGVHD（aGVHD following bone marrowtransplantation/bone marrow transplantation associated aGVHD,BMTx-aGVHD）的相关研究中推理而来。然而肝脏移植与骨髓移植在诸多方法都有明显的不同,并不能把LTx-aGVHD和BMTx-aGVHD等同对待,需要对LTx-aGVHD进行有针对性的研究以揭示其中的科学问题。既往对肝脏移植免疫学相关的动物实验研究主要是针对排斥反应和免疫耐受方面,鲜有aGVHD的研究报道。通过对临床LTx-aGVHD发病危险因素的分析认,现在为供受体HLA匹配程度与LTx-aGVHD的发生相关,尤其供、受间形成以供体为主导的MHC单体单向相合（donor-dominant one-way MHCmatching）是肝脏移植后发生aGVHD的显著危险因素之一。本研究中根据临床LTx-aGVHD发生的危险因素和aGVHD发生的必要条件,探索建立大鼠LTx-aGVHD模型的方法。并以所建立的模型为平台,检测肝脏移植后发生aGVHD受体大鼠体内Th1/Th2类细胞因子、CD4+CD25+调节性T细胞的变化规律、受体外周血单个核细胞中嵌合率的变化趋势,初步探讨LTx-aGVHD发生的病理生理学变化,为揭示其发生机制和制订快速准确的诊断方法、有效防治手段提供新的科学依据。材料与方法一、实验动物及分组以Lewis大鼠作为供体,Lewis或（LewisXBN）F1大鼠作为受体,根据肝脏移植及输入供体源脾脏细胞的数量分以下各组:（1）半同种异源大鼠肝脏移植组（semiallogeneic liver transplantation groups,Semi-LT groups）:以Lewis大鼠作为供体、（LewisXBN）F1大鼠作为受体,依据肝脏移植同时输入新鲜制备的供体源脾脏细胞数量的不同（0、1X108、2X108、3X108和4X108）分为5个亚组。（2）同种同基因大鼠肝脏移植组（syngeneic liver transplantation group,sLTgroup）:以Lewis大鼠作为供体和受体,肝脏移植后仅输入不含脾脏细胞的RPMI-1640液2ml。（3）半同种异源大鼠脾脏细胞移植组（semiallogeneicsplenocyte transplantation groups,Semi-ST groups）:以Lewis大鼠作为供体,（LewisXBN）F1大鼠作为受体,依据输入新鲜制备的供体源脾脏细胞数量的不同。（1X108、2X108、3X108和4X108）分为4个亚组。每亚组取6—8只受体,观察移植术后至100天,记录每只大鼠的存活时间和aGVHD发生情况,完成生存率的分析和比较。然后根据实验具体需要选择其中部分亚组进一步研究其相关的发生机制。二、aGVHD的检测术后隔日观测aGVHD相关大体表现如皮炎、脱毛、腹泻、弓背等现象。在动物死亡时或移植术后16天牺牲动物留取皮肤、大肠、小肠、肝脏组织标本,常规固定、染色后光镜下观察aGVHD相关病理表现,统计分析各组受体aGVHD的发生率、生存时间。三、外周血WBC、HGB、PLT检测及血清ALT、AST的检测各时间点留取外周血标本以全自动分析仪进行全血WBC、HGB、PLT和血清ALT、AST测定,以反映移植术后骨髓造血系统和肝脏受累情况。四、血清TH1/TH2类细胞因子含量检测血清IL-2、IFN-γ和TGF-β1含量应用ELISA法检测。五、外周血单个核细胞中CD4+CD25+调节性T细胞检测外周血血细胞梯度离心分离出单个核细胞后,应用流式细胞术检测CD4+CD25+调节性T细胞比例。六、外周血单个核细胞中受体嵌合率检测选择雄性Lewis大鼠为供体,雌性Lewis和（LewisXBN）F1大鼠作为受体。肝脏移植术后以Real-Time PCR方法检测受体中供体特有的基因（Y—染色体）的量及其与管家基因的比例来计算嵌合率。结果一、大鼠肝脏移植后急性移植物抗宿主疾病模型的构建以Lewis大鼠为供体、（LewisXBN）F1大鼠作为受体,单纯肝脏移植后受体的生存情况与同种同基因大鼠肝脏移植组相似,均获得长期存活（＞100天）无aGVHD发生。肝脏移植同时输入供体源脾脏细胞可以诱导LTx-aGVHD的发生,aGVHD的发生率随输入脾脏细胞数量的增加而增加。肝脏移植同时输入1X108个供体源脾脏细胞后,致死性aGVHD的发生率为16.7%（1/6）。将输入供体源脾脏细胞数量增加至2X108、3X108、4X108,致死性aGVHD的发生率分别达50%（3/6）、83.3%（5/6）和100%（8/8）。而仅分别输入1X108、2X108、3X108、4X108供体源脾脏细胞后,aGVHD的发生率较低,分别为0（0/6）、16.7%（1/6）、16.7%（1/6）和50%（3/6）。在半同种异源大鼠肝脏移植组中,（LewisXBN）F1受体大鼠肝脏移植后发生aGVHD的大体表现与半同种异源大鼠脾脏细胞移植组相似,均表现出体重下降、皮疹、脱毛、腹泻、弓背等典型表现。通过病理、外周血血细胞和肝脏功能分析,半同种异源大鼠脾脏细胞移植组中肝脏、皮肤、小肠和骨髓造血系统是主要受累靶器官。而在半同种异源大鼠肝脏移植组中主要受累的靶器官主要为皮肤、小肠和骨髓造血系统,移植肝脏无明显受累。二、肝脏移植后急性移植物抗宿主疾病的发生机制及CD4+CD25+调节性T细胞作用的初步研究同种同基因大鼠肝脏移植后外周血血清中IL-2和IFN-γ水平出现一过性升高,TGF-β1含量出现暂时性下降,随术后时间推移均逐渐恢复至正常大鼠水平。而外周血单个核淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例在术后各时间点保持平稳与正常大鼠相似无明显差异。在半同种异源大鼠肝脏移植组,发生aGVHD的（LewisXBN）F1受体大鼠外周血血清中IL-2和IFN-γ水平逐渐升高,在术后第4天与同种同基因大鼠肝脏移植组之间并无明显差异（P＞0.05）,而术后8、12、16天明显高于同种同基因大鼠肝脏移植组（P＜0.05）。外周血血清TGF-β1含量、单个核淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例随aGVHD的发生逐渐降低,至术后12、16天明显低于正常大鼠和同种同基因大鼠肝脏移植组（P＜0.05）。在未发生aGVHD的受体大鼠中,外周血血清中IL-2和IFN-γ水平与同种同基因大鼠肝脏移植组相比无明显差异,TGF-β1含量、单个核淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞的比例逐渐升高,在术后第12、16天明显高于与同种同基因大鼠肝脏移植组（P＜0.05）。三、肝脏移植后急性移植物抗宿主疾病中外周血嵌合体变化分析同种同基因大鼠肝脏移植组术后外周血中术后早期可检测出明显嵌合现象（第4天的嵌合率为1.37%±0.37%）。随着术后时间的延长,外周血中嵌合率迅速下降至术后第50天仅有微弱的嵌合体检测出（嵌合率为0.02%±+0.02%）,至术后第100天则无明显嵌合体检测出。半同种异源大鼠肝脏移植组中,未发生aGVHD受体外周血中嵌合率变化趋势均与同种同基因大鼠肝脏移植组相似。发生aGVHD受体中,外周血中嵌合体在术后第4、8、12和16天呈现快速升高趋势,并在术后早期（术后第4天）即明显高于同种同基因大鼠肝脏移植组和半同种异源大鼠肝脏移植组中未发生aGVHD的受体（P＜0.05）。结论一、以Lewis大鼠为供体、（LewisXBN）F1大鼠为受体,在供受体间形成以供体为主导的供受体间MHC单体单向相合现象时,通过肝脏移植同时输入一定数量的供体源脾脏细胞可以成功建立大鼠LTx-aGVHD模型;二、在所建立的大鼠LTx-aGVHD模型中,受体内存在TH1/TH2类细胞因子代谢紊乱,表现为IL-2和IFN-γ等TH1类细胞因子水平的升高和TGF-β1等TH2类细胞因子水平的降低,而肝脏移植手术本身对受体的损伤是导致术后早期受体内TH1/TH2类细胞因子代谢紊乱的主要原因,可能对LTx-aGVHD的发生有促进作用;三、CD4+CD25+调节性T细胞可能具有抑制LTx-aGVHD发生的作用,其机制可能与抑制IL-2、IFN-γ等TH1类细胞因子的产生,促进TGF-β1等TH2类细胞因子形成有关:四、在所建立的大鼠LTx-aGVHD模型中,术后早期受体外周血单个核细胞内形成的嵌合率即显著升高,且呈快速上升趋势,对其检测将有助于LTx-aGVHD的早期预测和诊断。
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标签：肝脏移植论文; 急性移植物抗宿主疾病论文; 动物模型论文; 调节性细胞论文; 嵌合体论文;