产菊粉酶耐热细菌的筛选及酶学性质研究

论文摘要

随着人们保健意识的提高,菊粉成为国内外关注的焦点,科学家们为了获得更高更纯的低聚果糖和高果糖浆,把研究的重点放在菊粉酶以及产菊粉酶的微生物上,这也是本文的目的所在。本文介绍了以菊粉为唯一碳源,50℃高温培养,从不同土壤样品中筛选出两株产菊粉酶的高温细菌,通过对其16S rDNA基因测序及Genbank数据库比对分析,发现两株细菌16S rDNA基因序列与Bacillus smithii的同源性高达99%,分别命名为Bacillus smithiiT4和Bacillus smithii T7,Genbank登录号分别为EU652724和EU628681。通过对不同碳源、不同氮源、不同金属离子、不同表面活性剂、不同培养温度、不同培养基初始pH值,不同转数以及不同培养时间对菊粉酶产量的影响研究及分析,优化得到的Bacillus smithii T4菊粉酶发酵条件为的:培养基组成,菊粉3.0%（w/v）,（YH4）H2PO40.5%（w/v）,酵母提取物05%（w/v）,CaCl2 0.5mM,Brij-35,0.006%（w/v）,pH 5.5;装液量50ml/250ml三角瓶,接种量6%（v/v）,转速150rpm;50℃下培养72h,菊粉酶活力可达到134.4 IU/ml,为优化前的2.2倍。Bacillus smithii T7的菊粉酶发酵优化条件为:培养基组成菊粉2.0%（w/v）,（NH4）H2PO4 0.5%（w/v）,酵母提取物0.5%（w/v）,Mg Cl2 0.5mM,Brij-35,0.006%（w/v）,pH 7.0;装液量50ml/250ml三角瓶,接种量6%（v/v）,转速200rpm;50℃下培养72h,菊粉酶活力可达到136.5 IU/ml,为优化前的2.7倍。在优化的发酵条件下,Bacillus smithii T7 72h发酵液在10000rpm,4℃下离心15min,收集上清得到粗酶液,通过10kD截留超滤浓缩,硫酸铵沉淀,10kD截留透析,DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱,Superdex 75凝胶过滤得到纯化的菊粉酶,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一组分,亚基分子量为47kD。水解菊粉产物经薄层层析（TLC）检测表明该酶为内切型菊粉酶;酶学性质研究表明,Bacillus smithii T7所产内切菊粉酶在70℃,pH4.5时酶活达到最高;在pH4.5-6.5时,酶的稳定性较好,在70℃,80℃的半衰期分别为9h和2.5h;Fe2+可显著提高内切菊粉酶的酶活,而Cu2+,Ba2+,K+和Na+抑制了菊粉酶活力。酶动力学分析表明菊粉是其良好的天然底物,Km值为4.17mmol/L,Vmax为833IU/mg protein。综上所述,筛选得到的Bacillus smithii T7高温细菌,可产生热稳定的、特异性较强的内切型菊粉酶,在菊芋产品应用及开发方面,具有良好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 菊粉
• 1.1.1 菊粉的性质
• 1.1.2 菊粉的营养与生理功能
• 1.1.3 菊粉的来源
• 1.1.4 菊粉的深加工
• 1.2 菊粉酶
• 1.2.1 菊粉酶的分类
• 1.2.2 菊粉酶的性质
• 1.2.3 菊粉酶的来源
• 1.2.4 菊粉酶的纯化方法
• 1.2.5 产菊粉酶的微生物及发酵条件研究现状
• 1.2.6 菊粉酶酶性质研究现状
• 1.2.7 菊粉酶的应用
• 1.3 题背景及意义
• 1.3.1 国外菊粉酶研究情况
• 1.3.2 我国菊粉业的发展情况
• 1.3.3 菊粉及低聚果糖的研究意义
• 1.3.4 研究目的
• 1.4 本课题的研究内容
• 2 产菊粉酶耐热细菌的分离,筛选及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料和试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 主要实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 初筛结果
• 2.3.2 16S rDNA扩增和测序
• 2.3.3 Bacillus smithii T4和T7的系统发育分析
• 2.3.4 细菌生理生化实验结果
• 2.4 本章小结
• 3 Bacillus smithii T4和T7产菊粉酶发酵条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料和试剂
• 3.2.2 主要实验仪器
• 3.2.3 主要实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 碳源对Bacillus smithii T4和Bacillus smithii T7产菊粉酶的影响
• 3.3.2 不同氮源的影响
• 3.3.3 不同金属离子对菊粉酶产量的影响
• 3.3.4 不同的表面活性剂对菊粉酶产量的影响
• 3.3.5 不同的初始pH对菊粉酶产量的影响
• 3.3.6 培养温度对菊粉酶产量的影响
• 3.3.7 菌龄和接种量对菊粉产量的影响
• 3.3.8 转数的影响
• 3.3.9 不同培养时间对菊粉酶产量及生物量的影响
• 3.4 本章小结
• 4 Bacillus smithii T7所产菊粉酶的分离纯化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料与试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 主要实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4）2SO₄分级沉淀'>4.3.1 （NH₄）2SO₄分级沉淀
• 4.3.2 透析
• 4.3.3 DEAE-Sepharose CL-6B离子交换色谱
• 4.3.4 Superdex 75凝胶过滤色谱
• 4.3.5 纯化结果
• 4.3.6 酶组分纯度鉴定与分子量测定
• 4.4 本章小结
• 5 Bacillus smithii T7所产菊粉酶的酶学性质
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菊粉酶
• 5.2.2 实验设备
• 5.2.3 主要实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 水解产物的分析
• 5.3.2 温度对酶活大小的影响
• 5.3.3 pH对菊粉酶的影响
• 5.3.4 菊粉酶动力学常数的测定
• 5.3.5 金属离子和其它化学物质对菊粉酶的影响
• 5.4 本章小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 创新点
• 参考文献
• 附录A Bacillus smithii T4 16S rDNA
• 附录B Bacillus smithii T7 16s rDNA
• 附录C Bacillus smithii T4和T7的序列图谱
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢