生物法耦合膜技术制备甘草次酸的研究

论文摘要

本文采用生物发酵法耦合膜分离技术制备甘草次酸。建立了对甘草次酸的检测方法,对微生物摇瓶培养、种子罐发酵工艺及发酵罐转化工艺进行了系统的研究,对分离膜的选型,膜除杂浓缩工艺路线的确定和甘草次酸的精制进行了全面的探讨。1.建立了甘草酸和甘草次酸的高效液相色谱同步检测方法,并确定了色谱条件。分析甘草次酸的相关系数R2=0.999983,重现性实验标准偏差为0.00088,相对标准偏差为0.00061%。该方法准确度高,可靠性强。2.以甘草酸的转化率为指标,确定了微生物摇瓶培养、种子罐发酵、20L发酵罐转化及200L扩大发酵转化的各项工艺参数。采用这些工艺参数进行实验,摇瓶培养甘草酸转化率可达到78.62%,种子罐发酵获得的生物量比摇瓶培养高出33%,20L发酵甘草酸转化率高达77.34%,200L发酵甘草酸转化率也可达到74.72%。3.对甘草次酸发酵液膜除杂、浓缩工艺进行了研究,讨论了不同分离膜对发酵液除杂、浓缩的效果。发现超滤膜Ⅰ对发酵液中蛋白质和固形物的去除率高,纳滤膜Ⅱ对甘草次酸的浓缩效果较好。并确定了采用超滤膜Ⅰ除杂-纳滤膜Ⅱ浓缩二级膜工艺作为发酵产物甘草次酸的膜除杂浓缩工艺。4.对甘草次酸的精制进行了研究,确定了甘草次酸的精制预处理工艺及各项参数。选用苯乙烯型D101非极性大孔吸附树脂对甘草次酸进行纯化,并找到了最佳洗脱方案。经过预处理后,可以获得纯度为97.50%的甘草次酸。而经过大孔吸附树脂的吸附和洗脱后,能够获得纯度高达98.97%的甘草次酸成品。本课题研究采用微生物发酵法生产甘草次酸,用膜分离技术对甘草次酸发酵液进行除杂和浓缩,再用大孔吸附树脂精制甘草次酸,最终获得了纯度高达98.97%的甘草次酸成品。该工艺路线成本低,收率高,污染小,解决了目前我国及全世界范围内因采用酸解法生产甘草次酸过程中存在的原材料消耗高,酸解条件不易把握,工艺路线长,产品纯度低,环境污染严重等问题,达到了清洁生产的目的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 甘草的研究现状
• 1.1.1 甘草的资源分布
• 1.1.2 甘草的生态特性
• 1.1.3 甘草的形态特征
• 1.1.4 甘草的化学成分及其物理化学性质
• 1.1.5 甘草次酸的药理作用
• 1.1.6 甘草次酸含量的测定方法
• 1.2 发酵工程及其现状
• 1.2.1 发酵工程的历史
• 1.2.2 发酵工程的特点
• 1.2.3 发酵工程的操作步骤
• 1.2.4 发酵工程的发酵方式
• 1.2.5 发酵工程技术的应用与发展趋势
• 1.3 膜分离技术
• 1.3.1 膜分离技术的历史
• 1.3.2 膜分离技术的基本原理
• 1.3.3 膜分离过程的分类
• 1.3.4 膜及膜组件的分类
• 1.3.5 膜分离技术在中药有效成分提取中的应用现状和发展前景
• 1.4 甘草次酸制备方法的研究现状及存在的问题
• 1.4.1 目前甘草次酸的制备方法
• 1.4.2 目前甘草次酸生产工艺中存在的问题
• 1.5 本课题研究的目的、技术路线及内容
• 1.5.1 本课题研究的目的
• 1.5.2 研究方法及技术路线
• 1.5.3 本课题研究的内容
• 第2章 分析方法的建立
• 2.1 实验药品与仪器
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 样品及来源
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 HPLC分析条件的确定
• 2.2.1 标准品的配制
• 2.2.2 检测波长的确定
• 2.2.3 流动相的选择
• 2.2.4 标准曲线的绘制
• 2.2.5 重现性实验
• 2.3 小结
• 第3章 摇瓶培养条件优化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌种保藏培养基配制
• 3.2.2 发酵培养基
• 3.2.3 HPLC法检测甘草酸转化率
• 3.2.4 发酵初始pH的确定
• 3.2.5 HC-12 产酶特性
• 3.2.6 葡萄糖醛酸酶诱导作用的确定
• 3.2.7 葡萄糖醛酸酶的作用部位
• 3.2.8 复杂系统定向调控技术对摇瓶培养的发酵参数进行优化
• 3.2.9 甘草酸粗品中单糖及蛋白质的测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 发酵初始pH对转化的影响
• 3.3.2 复杂系统定向调控技术优化结果
• 3.3.3 甘草酸粗品糖及蛋白含量
• 3.4 小结
• 第4章 种子罐发酵工艺优化
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 种子培养基
• 4.2.2 生物量的检测
• 4.2.3 单糖检测
• 4.2.4 pH和溶氧的检测
• 4.2.5 复杂系统定向调控技术对种子罐的发酵参数进行优化
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 第一次诊断实验结果
• 4.3.2 小结
• 4.4 第二次诊断实验结果
• 4.4.1 显微镜下菌体生长形态情况
• 4.4.2 生物量
• 4.4.3 pH变化
• 4.4.4 溶氧变化
• 4.4.5 糖浓度变化
• 4.5 小结
• 第5章 发酵罐转化工艺优化
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 种子培养
• 5.2.2 发酵培养基
• 5.2.3 复杂系统定向调控技术对发酵罐的发酵参数进行优化
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 第一次诊断实验结果
• 5.3.2 第二次诊断实验结果
• 5.3.3 200L发酵罐的扩大实验
• 5.4 小结
• 第6章 发酵产物甘草次酸的膜除杂浓缩实验
• 6.1 实验仪器与材料
• 6.2 超滤膜除杂实验
• 6.2.1 实验目的
• 6.2.2 实验方法
• 6.2.3 实验结果
• 6.3 精密过滤器过滤-纳滤膜浓缩实验
• 6.3.1 实验目的
• 6.3.2 实验方法
• 6.3.3 实验结果
• 6.4 超滤膜除杂-纳滤膜浓缩实验
• 6.4.1 实验目的
• 6.4.2 实验方法
• 6.4.3 实验结果
• 6.5 小结
• 第7章 甘草次酸的精制
• 7.1 实验仪器与材料
• 7.1.1 实验仪器
• 7.1.2 实验材料
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 甘草次酸的精制预处理
• 7.2.2 甘草次酸的精制
• 7.3 实验结果
• 7.3.1 提取单因素实验结果
• 7.3.2 极限提取得率实验结果
• 7.3.3 大孔吸附树脂的确定
• 7.3.4 洗脱剂的确定
• 7.3.5 喷雾干燥
• 7.4 小结
• 第8章 发酵法生产甘草次酸的成本核算
• 8.1 原材料成本
• 8.2 生产成本
• 8.2.1 发酵成本
• 8.2.2 分离成本
• 8.3 人工费
• 8.4 厂房及设备折旧
• 8.5 总生产成本及利润值
• 第9章 结论
• 9.1 总结
• 9.1.1 甘草次酸检测方法的确定
• 9.1.2 摇瓶培养各项参数的确定
• 9.1.3 种子罐发酵工艺各项参数的确定
• 9.1.4 发酵罐转化工艺各项参数的确定
• 9.1.5 膜除杂浓缩工艺及各项参数的确定
• 9.1.6 甘草次酸精制工艺的确定
• 9.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 1. 硕士学习期间参与的课题研究
• 2. 硕士学习期间发表的论文