马传染性贫血病毒基因转移载体的优化和改造

论文摘要

马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus, EIAV）是一种非灵长类慢病毒,而且是基因组结构最简单的慢病毒,可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上并在感染细胞和子代细胞中表达病毒基因,可作为将外源基因引入细胞的载体。孙成群利用我国EIAV的研究成果,在中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株（EIAV-DLA）感染性克隆（pOK8266）的基础上,采用反向遗传学技术,构建了包括EIAV载体质粒、EIAV-gag/pol/rev包装质粒和VSV-G囊膜表达质粒的EIAV三质粒基因转移载体系统。本研究是孙成群开发的中国EIAV三质粒基因转移载体系统的继续,将对其进行一系列优化和改造,主要目的在于进一步提高EIAV基因转移载体的转基因效率,同时为四质粒基因转移载体系统的构建奠定基础。研究内容及结果如下:1.利用土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）对EIAV基因转移载体质粒进行修饰,构建了WPRE正向插入pcPPTPRE（+）的EIAV载体质粒pcPPTWPRE。转染实验表明,在体外传代细胞系HEK293中,WPRE可以显著提高EIAV基因转移载体的外源蛋白表达能力;而在DF-1细胞中,载体pcPPTWPRE表达外源蛋白的能力略高于pcPPTPRE（+）,虽然两者的表达量均不高。2.利用杂合启动子人巨细胞病毒立即早期增强子/鸡β-肌动蛋白启动子（CAG启动子）构建EIAV基因转移载体。PCR扩增CAG核心启动子（不含鸡β-肌动蛋白第一内含子）,将其替换EIAV载体质粒pcPPTWPRE中的内部启动子人巨细胞病毒立即早期增强子/启动子（CMVIE启动子）构建了EIAV载体质粒pcPPTEIACAGp。体外转染实验表明,CAG核心启动子在鸡体外培养细胞DF-1中启动外源基因表达的能力明显高于CMVIE启动子;而在HEK293细胞中,两者启动外源基因表达的能力相当。3.在CAG启动子的基础上,利用酶切的方式分别构建了含部分鸡β-肌动蛋白第一内含子的EIAV载体质粒pWCAGP0.8和含全长内含子的EIAV载体质粒pWCAGP1.6,研究鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV基因转移载体质粒外源蛋白表达能力的影响。体外转染实验结果表明,不含内含子的EIAV载体质粒pcPPTEIACAGp表达外源蛋白的能力优于含部分或全长内含子的载体pWCAGP0.8和pWCAGP1.6,鸡β-肌动蛋白第一内含子并没有提高EIAV载体质粒的外源蛋白表达能力,反而降低了其表达水平。4. PCR扩增rev反应元件RRE序列和EIAV 5′端R-U5序列,将其依次亚克隆入EIAV蛋白表达载体pCDGP中,借此研究RRE序列和5′端R-U5区对EIAV结构蛋白表达的影响。体外表达实验表明,EIAV-DLA基因组5`端的R区和U5区对EIAV结构蛋白的转录起决定性作用;Rev蛋白及其反应元件RRE序列对gag/pol蛋白表达载体的表达是必不可少的。改造之后的gag/pol表达载体pSRU5GPR与rev表达载体共转染HEK293,IFA检测获得了明显的蛋白表达。上述研究结果将为中国马传染性贫血病毒四质粒基因转移载体系统的构建提供理论基础和技术支持,也将为人类的基因治疗、转基因动物的制备及结合RNAi技术研究基因功能提供一个新的方法。

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摘要

ABSTRACT

第一章马传染性贫血病毒基因转移载体研究进展

1.1 基因转移载体的类型

1.1.1 非病毒载体系统

1.1.2 病毒载体系统

1.2 马传染性贫血病毒概述

1.3 马传染性贫血病毒的分子生物学特性

1.3.1 EIAV 基因组结构及其功能

1.3.2 EIAV 的基因及其编码蛋白

1.4 EIAV 非编码区LTR 相关研究进展

1.5 马传染性贫血病毒的生活周期

1.6 EIAV 基因转移载体的构建原理

1.6.1 EIAV 基因转移载体质粒

1.6.2 EIAV 基因转移载体的包装系统

1.6.3 EIAV 载体的囊膜伪型化

1.6.4 EIAV 基因转移载体的优化

1.7 EIAV 基因转移载体的应用

1.8 本研究的背景、内容和意义

第二章马传染性贫血病毒基因转移载体质粒的优化

2.1 材料

2.1.1 细胞、菌种和质粒

2.1.2 主要分子生物学试剂

2.1.3 引物设计合成

2.1.4 细菌培养基及常用缓冲液的配制

2.1.5 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 PCR 扩增WPRE 和CAG 核心启动子

2.2.2 PCR 产物的纯化及其与pGM-T 载体的连接

2 法）'>2.2.3 新鲜大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（CaCl₂法）

2.2.4 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α

2.2.5 重组质粒pGM-WPRE 和pGM-CAGp 的提取

2.2.6 重组质粒pGM-WPRE 阳性克隆的筛选与鉴定

2.2.7 重组质粒pGM-CAGp 阳性克隆的筛选与鉴定

2.2.8 pGM-WPRE 和pcPPTPRE（+）的NotⅠ酶切与回收

2.2.9 重组质粒pcPPTWPRE 的制备

2.2.10 重组质粒pcPPTWPRE 阳性克隆的筛选与鉴定

2.2.11 pGM-CAGp 和pcPPTWPRE 的KpnⅠ酶切与回收

2.2.12 重组质粒pcPPTEIACAGp 的制备

2.2.13 重组质粒pcPPTEIACAGp 阳性克隆的筛选与鉴定

2.2.14 转染用EIAV 基因转移载体质粒的制备

2.2.15 EIAV 基因转移载体质粒的转染

2.2.16 EGFP 表达量的观察与比较

2.3 结果

2.3.1 WPRE 及CAG 核心启动子的PCR 扩增结果

2.3.2 重组质粒pGM-WPRE 阳性克隆的鉴定结果

2.3.3 重组质粒pGM-CAGp 阳性克隆的鉴定结果

2.3.4 重组质粒pGM-WPRE 和pGM-CAGp 测序结果

2.3.5 pGM-WPRE 和pcPPTPRE（+）的酶切

2.3.6 重组质粒pcPPTWPRE 阳性克隆的鉴定结果

2.3.7 pGM-CAGp 和pcPPTWPRE 的酶切

2.3.8 重组质粒pcPPTEIACAGp 阳性克隆的鉴定结果

2.3.9 转染用EIAV 载体质粒的浓度测定及转染方案

2.3.10 EGFP 蛋白在荧光显微镜下的观察结果

2.3.11 流式细胞仪的检测结果

2.4 讨论

2.4.1 WPRE 提高了EIAV 载体质粒的外源蛋白表达能力

2.4.2 CAG 核心启动子与CMVIE 启动子的比较

2.4.3 EIAV 载体质粒宿主细胞的选择

2.4.4 影响磷酸钙转染法转染效率的因素

第三章鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV 载体质粒外源蛋白表达能力的影响

3.1 材料

3.1.1 细胞、菌种和质粒

3.1.2 主要分子生物学试剂

3.1.3 TSS 溶液的配制

3.1.4 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 质粒pcPPTWPRE 和pCAGG-MCS 的Sal ? 酶切

3.2.2 线性质粒pcPPTWPRE 和pCAGG-MCS 的Apa ? 酶切

3.2.3 线性质粒pcPPTWPRE 和pCAGG-MCS 的Kpn ? 酶切

3.2.4 酶切产物的纯化回收

3.2.5 含部分内含子的CAG 启动子与pcPPTWPRE 载体的连接

3.2.6 全长CAG 启动子与pcPPTWPRE 载体的连接

3.2.7 新鲜大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备（TSS 一步法）

3.2.8 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α

3.2.9 重组质粒pWCAGP0.8 和pWCAGP1.6 的提取

3.2.10 重组质粒pWCAGP0.8 阳性克隆的筛选与鉴定

3.2.11 重组质粒pWCAGP1.6 阳性克隆的筛选与鉴定

3.2.12 转染用EIAV 基因转移载体质粒的制备

3.2.13 EIAV 基因转移载体质粒的转染

3.2.14 EGFP 表达量的观察与比较

3.3 结果

3.3.1 重组质粒的SalⅠ和ApaⅠ双酶切

3.3.2 重组质粒pWCAGP0.8 阳性克隆的鉴定结果

3.3.3 重组质粒的SalⅠ和KpnⅠ双酶切

3.3.4 重组质粒pWCAGP1.6 阳性克隆的鉴定结果

3.3.5 转染用质粒的浓度测定及转染方案

3.3.6 EGFP 蛋白在荧光显微镜下的观察结果

3.3.7 流式细胞仪的检测结果

3.4 讨论

3.4.1 内含子对基因表达调控的影响

3.4.2 内含子对EIAV 载体质粒蛋白表达能力的影响

第四章马传染性贫血病毒gag/pol 蛋白表达载体的改造

4.1 材料

4.1.1 细胞和菌种

4.1.2 质粒

4.1.3 主要实验试剂

4.1.4 主要仪器设备

4.1.5 引物设计合成

4.2 方法

4.2.1 PCR 扩增RRE 片断和5′端RU5 区

4.2.2 RRE 和RU5 区PCR 产物的纯化回收

4.2.3 重组质粒pCDGPR 的构建

4.2.4 重组质粒pCDGPR 阳性克隆的筛选与鉴定

4.2.5 重组质粒pRU5GPR 的构建

4.2.6 重组质粒pRU5GPR 阳性克隆的筛选与鉴定

4.2.7 重组质粒pCDGPR 和pRU5GPR 的定点突变

4.2.8 重组质粒pCDSGPR 和pSRU5GPR 阳性克隆的筛选

4.2.9 转染用EIAV gag/pol 蛋白表达载体的制备

4.2.10 EIAV gag/pol 蛋白表达载体的体外表达与检测

4.3 结果

4.3.1 RRE 片断和RU5 区的PCR 扩增

4.3.2 重组质粒pCDGPR 阳性克隆的鉴定

4.3.3 重组质粒pRU5GPR 阳性克隆的鉴定

4.3.4 RU5 和RRE 的测序结果及分析

4.3.5 SOE-PCR 法定点突变的扩增结果

4.3.6 重组质粒pCDSGPR 和pSRU5GPR 的构建

4.3.7 SOE-PCR 定点突变的测序结果及分析

4.3.8 EIAV gag/pol 表达载体的浓度测定及转染方案

4.3.9 EIAV 蛋白表达载体转染后的表达

4.4 讨论

4.4.1 关于质粒pOK8266 与pOK8266T

4.4.2 RRE 对EIAV gag/pol 载体表达的影响

4.4.3 EIAV 5′-LTR RU5 区对EIAV gag/pol 载体表达的影响

4.4.4 关于SOE-PCR 定点突变

4.4.5 关于EIAV 蛋白表达载体的IFA 检测结果

结论

参考文献

致谢

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