论文摘要
叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官,对植物的生命活动起着重要的作用,叶片的发育作为植物形态建成的一个重要方面,关系到植物株型和农业产量的形成。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,卷叶性状是超高产育种的一项重要形态指标。因此,探明卷叶形成的分子机理,不仅能使我们更多地了解水稻的叶发育机制,而且能帮助我们通过分子设计改良株型。利用60Co-γ射线辐射水稻品种中花11,在M2代获得了三份卷叶突变体:M425、M429和M475,在日本晴的组培后代中得到一份卷叶突变体M7。其中,M425和M7表型相似,叶片都表现筒状卷曲,且籽粒畸形;M429和M475两者表型相似,叶片半卷,籽粒增多呈密穗。本研究对这些卷叶突变体进行了形态观察、突变性状的遗传分析、基因的等位性检测及图位克隆,主要研究结果如下:一、水稻卷叶基因RL9的定位和克隆1、对叶片细胞结构进行电镜观察,发现rl9-1突变体（M425）叶片小维管束远轴面厚壁细胞缺失,叶肉细胞取而代之,近轴面特有的茸毛在远轴面也有分布,而且叶绿体发育异常,基粒片层排列紊乱。2、将rl9-1突变体与中花11配制杂交,F1植株叶片表现平展,F2中正常株和突变株的分离比符合3:1,表明突变性状受单隐性基因控制。3、利用rl9-1突变体与籼稻品种Dular杂交产生的F2和F3群体,运用SSR、STS和CAPS标记,将RL9基因定位在第9染色体PAC克隆AP005904上22kb的区段上;此外,利用图位克隆的方法分离了一个与rl9-1等位的突变基因rl9-2,来自突变体M7。4、通过基因预测发现,在RL9基因所在的22kb内,仅有一个候选基因,预测编码类似MYB的蛋白;对该基因的测序结果表明,rl9-1在第一个外显子中发生了5个碱基的缺失,引起移码:rl9-2在第一个内含子和第二个外显子的剪切位点处发生了1个碱基的替换,使内含子不能被正确剪切,引起RL9阅读框改变,导致RL9功能的丧失。5、通过RT-PCR的方法确定了RL9基因位于AP005904上103061-108515处,编码区长1134bp,编码377个氨基酸,包含6个外显子和5个内含子。6、将来自日本晴BAC克隆的全长RL9基因导入rl9-1突变体后,rl9-1恢复成野生型表型,证实RL9是控制M425卷叶性状的基因。7、半定量RT-PCR结果表明,RL9基因在植株所有器官中均有表达,在根、叶片和穗中的表达量较高,在茎和叶鞘中表达量较低。8、对RL9所编码的氨基酸序列进行分析发现,RL9含有一个GARP结构域。9、将RL9蛋白序列与数据库中已命名的GARP超家族成员进行多序列比对,以邻位相连法构建进化树,发现RL9与拟南芥KANADI同源,根据KANADI在拟南芥中的功能,结合RL9功能丧失突变在水稻中的表现,推测RL9控制叶片的远轴发育。10、将RL9与GFP融合在洋葱表皮瞬时表达,融合蛋白定位在细胞核内,表明RL9是一个转录因子。二、卷叶基因RL10的定位和克隆1、对叶片细胞结构进行电镜观察,发现rl10-1突变体（M429）叶片部分小维管束远轴面的厚壁细胞缺失,并有少量类似C4植物的“花环”结构产生,而且近轴面所属的茸毛在远轴面也有分布。2、将rl10-1突变体与中花11配制杂交,F1植株叶片表现平展,F2中正常株和突变株的分离比符合3:1,表明突变性状受单隐性基因控制。3、利用rl10-1突变体与籼稻品种Dular杂交产生的F2和F3群体,将RL10基因定位在STS标记f70和f87之间约38kb的区段内;同样,利用图位克隆的方法分离了一个与rl10-1等位的突变基因rl10-2,来自突变体M475。4、通过基因预测发现,在RL10基因定位的38kb内,存在5个基因,对它们进行测序分析发现,第二个基因在两个突变体中发生了序列变化,rl10-1在外显子中发生了单碱基替换（T→C）,导致一个丝氨酸突变成脯氨酸,rl10-2在终止密码子前发生了两个碱基的缺失,导致翻译终止滞后。5、对野生型品种的候选基因2进行RNA干涉,产生类似突变体的表型,表明该基因是控制rl10突变性状的基因。6、半定量RT-PCR结果表明,RL10基因在植株所有器官中均有表达,在叶片、叶鞘和穗中的表达量较高,在根和茎中的表达量稍低。