组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）突变体乳腺特异性表达载体的构建及其细胞表达研究

论文摘要

组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator,t-PA）是治疗血栓性疾病的重要药物。自1980年首次证实t-PA具有高效特异性的溶栓作用以来,t-PA因其与纤维蛋白亲和力高、引起全身出血倾向小、溶栓能力强等优点而被广泛用于各种血栓性疾病的治疗。但是t-PA在血液中的半衰期甚短（3min～5min）,在临床治疗中必须大剂量静脉滴注才能维持其有效浓度,增加了全身出血的危险。目前,临床上用于血栓性疾病治疗的t-PA主要靠大规模培养哺乳动物细胞生产,存在生产成本高、产量小、浓度低等缺陷,致使t-PA价格昂贵临床治疗费用高。利用动物乳腺生物反应器来生产不仅维持生产的成本低,而且产量高还能进行翻译后修饰和正确折叠。本研究以山羊β-乳球蛋白基因调控区为指导元件,以人组织型纤溶酶原激活剂F、E、K1区及Asp 117糖基化位点缺失体为表达序列,构建了乳腺特异性表达载体pBCrt-PA,转染山羊乳腺上皮细胞,筛选获得稳定表达细胞株。应用PCR法以实验室保存的野生型t-PA cDNA为模板扩增出长度约1.1kb含K2和P区的t-PA部分序列。同时,合成一段长度为60bp的山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列。利用定向克隆法,将山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列插入到克隆载体pCEP4中。然后,将已扩增的t-PA cDNA序列定向克隆到山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列之后。再将含有CMV、山羊β-乳球蛋白信号肽编码序列、t-PA以及SV40p（A）序列的基因片段,克隆到实验室已有的通用乳腺特异性表达载体BnF95中,最终构建了由山羊β-乳球蛋白基因5′、3′调控序列指导的t-PA cDNA突变体乳腺特异性表达载体pBCrt-PA。进一步用Sal I、Not I双酶切pBCrt-PA回收大小约9.8kb的转基因片段。通过电击转染法将转基因片段导入体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞。经G418筛选三周后得到62株抗G418的阳性细胞株。提取抗G418的阳性细胞株基因组DNA,经PCR检测初步确认有22株细胞中整合了外源基因。用催乳素对PCR检测阳性细胞株进行诱导表达,收集诱导表达48h后细胞上清进行ELISA检测。检测结果表明,有2株PCR检测阳性细胞株可表达t-PA突变体,但表达量相对较低,其表达水平分别为5.98ng/ml和2.35ng/ml。对于表达产物的活性、半衰期检测以及如何提高表达水平有待进一步研究。t-PA突变体基因的克隆以及这种载体构建思路,为将来制备转基因山羊乳腺生物反应器大量生产特异溶栓活性强、半衰期延长的新型溶栓药物,提供了强有力的实验依据,具有重要的指导意义。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 组织型纤溶酶原激活剂发展简史
• 2 组织型纤溶酶原激活剂的生物学特征
• 2.1 组织型纤溶酶原激活剂基因的克隆和序列分析
• 2.2 组织型纤溶酶原激活剂的结构与功能
• 2.3 组织型纤溶酶原激活剂变构体
• 3 利用转基因动物乳腺生物反应器生产t-PA
• 3.1 乳腺生物反应器的概念及其优越性
• 3.2 t-PA 在原核和真核细胞中的表达
• 3.3 t-PA 在转基因动物乳腺中的表达
• 3.4 小结与展望
• 第二章 t-PA 突变体乳腺特异性表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒pT-tPA 酶切鉴定及序列分析结果
• 2.2 重组质粒pCBS 酶切鉴定结果
• 2.3 重组质粒pCrt-PA 酶切鉴定结果
• 2.4 重组质粒pBCrt-PA 酶切鉴定结果
• 3 讨论
• 第三章 t-PA 突变体乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞中的初步验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 乳腺上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化培养
• 2.2 乳腺上皮细胞体外培养的生长特点
• 2.3 G418 抗性筛选
• 2.4 电击转染
• 2.5 阳性细胞克隆PCR 检测结果
• 2.6 阳性细胞克隆ELISA 检测结果
• 3 讨论
• 3.1 奶山羊乳腺上皮细胞的培养
• 3.2 电击转染
• 3.3 t-PA 突变体在乳腺上皮细胞中的表达
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 研究生期间发表论文目录
• 致谢