牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的研制及应用

论文摘要

淋巴囊肿病（Lymphocystis disease LCD）是一种世界范围流行的鱼类病毒病,病原是淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus, LCDV）。患病鱼的主要症状是体表长有皮肤瘤状和菜花状的赘生物,丧失商品价值。自1997年在威海地区养殖的牙鲆中首次发生以来,该病迅速蔓延至浙江、辽宁、河北等省沿海地区。近年来该病一直在养殖牙鲆中流行,给水产养殖业造成的经济损失高达数百亿元之巨。本论文对淋巴囊肿病毒纯化方法、病毒结构蛋白及其抗原性、单克隆抗体的制备、病毒培养及其感染牙鲆鳃细胞的动态变化进行了研究,取得了以下结果:优化了病毒的提纯方法并使之程序化;判定病毒结构蛋白带共有22条,且三条蛋白带具有抗原性;制备了单克隆抗体,并应用多种免疫学方法证实了单抗针对病毒的特异性,确认了五个蛋白为病毒的衣壳蛋白,并且在这五个蛋白多肽上具有线形抗原决定簇;发现病毒感染鳃细胞后24小时之内,开始复制,48-72小时达到顶峰。优化的LCDV病毒提纯的方法为:首先剥离囊肿组织表面的薄膜,然后采用多次匀浆处理肿瘤组织,尔后将组织匀浆液于650×g和1 800×g分别离心20 min,将离心获得的上清液配成30%（W/W）蔗糖溶液,4℃条件下进行78, 500×g,180 min超速离心,病毒沉淀用TNE缓冲液重悬后进行蔗糖密度梯度离心即可。纯化的LCDV病毒负染后,电镜观察发现其呈近似于圆形的多角形,结构完整。LCDV病毒经SDS-PAGE,硝酸银染色,电泳图谱清晰显示其结构蛋白共有22条,且分子量主要集中在123-26 kDa之间。应用兔抗LCDV血清分析结构蛋白的抗原性,结果显示分子量为123.55、65.292和54.438 kDa的3条蛋白带发生了免疫反应,其中分子量为65.292 kDa的蛋白带反应强度明显高于其它2条蛋白带。以纯化的LCDV为抗原免疫Balb/C小鼠,采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得了13株单克隆抗体（1A8、1D7、2B6、2F6、2D11、2G6、3A5、3G3、3D6、3G12、4C8、4D9、4B6）。ELISA初步筛选结果显示,这13株杂交瘤细胞分泌的抗体的吸光值相对于其他阳性杂交瘤细胞的较高,免

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鱼类病毒病研究概况
• 1.2 淋巴囊肿病的研究进展
• 1.3 鱼类病毒病检测与诊断技术
• 1.4 单克隆抗体技术在水生动物病毒研究中的应用
• 2 淋巴囊肿病毒纯化方法及其结构蛋白的研究
• 2.1 淋巴囊肿病毒的纯化
• 2.2 淋巴囊肿病毒结构蛋白的研究
• 2.3 淋淋巴囊肿病毒结构蛋白抗原性的分析
• 3 淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备及其特性分析
• 3.1 淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备
• 3.2 淋巴囊肿病毒单克隆抗体的筛选
• 3.3 Western blotting 分析抗原决定簇分子量
• 3.4 免疫电镜定位单抗特异性结合的抗原决定簇
• 4 淋巴囊肿病毒单克隆抗体的应用
• 4.1 淋巴囊肿病毒感染牙鲆鳃细胞系
• 4.2 应用单抗研究 LCDV 在 FG 细胞中的增殖
• 参考文献
• 致谢