鹅卵泡差异显示表达序列标签（ESTs）的筛选及分析

论文摘要

本研究以产蛋期扬州鹅为研究材料,采用Oligo(dT10)M（A/G/C）为锚定引物与23个随机引物之间共69个组合的RT-PCR反应对成熟卵泡总RNA进行DDRT-PCR分析,并利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术分离DDRT-PCR产物,共获得差异条带18条。经过PCR再扩增、电泳检测和纯化,共得到差异显示的cDNA片段10条。经二次PCR与第一次PCR结果比较,再经Dot-blot验证后得到7条差异表达cDNA片段,委托上海杰瑞生物工程有限公司克隆测序,获得5个表达序列标签,且经1.5%琼脂糖电泳检测显示这些条带比非差异显示条带弱,推测差异表达的基因表达丰度低。五个差异显示ESTs去除载体序列后用Blast检索发现:在这5条差异表达片段中,ESTYZGF01与人甲硫氨酸腺苷基转移酶II（MAT II）同源,同源性为95%,ESTYZGF02与鸡mKIAA0840 protein基因同源,同源性为94%。其余ESTYZGF03、ESTYZGF04、ESTYZGF05个与已知基因或序列无任何同源性,可能是尚未发现的新基因。最小的排卵前卵泡（SPF） MAT IIβ亚基表达水平的上升可能通过增加E2合成途径的原料来增加E2水平,或上调抗凋亡基因的表达而利于卵泡的选择。而FBXL-7可能通过参与SCF复合体的形成,降解一种转录的激活因子或抑制因子而参与卵泡的选择。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 文献综述
• 1. mRNA 差异显示方法的原理
• 2. mRNA 差异显示方法的优缺点及改进
• 2.1 mRNA 差异显示方法的优缺点
• 2.2 mRNA 差异显示方法的改进
• 2.2.1 mRNA 差异显示降低假阳性的策略
• 2.2.2 非放射性同位素银染差异显示方法的建立
• 3. mRNA 差异显示方法的应用
• 3.1 mRNA 差异显示技术克隆 FSH/LH 应答基因
• 3.2 mRNA 差异显示技术克隆排卵特异表达基因
• 3.3 mRNA 差异显示技术在禽类卵泡发育中的应用
• 4. mRNA 差异显示方法同其他方法的比较
• 4.1 mRNA 差异显示与消减杂交类技术
• 4.2 mRNA差异显示与基因表达的系列分析技术
• 4.3 mRNA差异显示和基因芯片
• 5. 结语
• 试验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验对象
• 1.1.1 样品采集
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 主要溶液的配制
• 1.2 总RNA的提取及RNA完整性检测
• 1.2.1 总 RNA 提取
• 1.2.2 RNA 的 DNase 消化
• 1.3 反转录
• 1.4 PCR 扩增
• 1.5 聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染
• 1.5.1 非变性1096聚丙烯酰氨凝胶的配制
• 1.5.2 电泳
• 1.5.3 银染
• 1.6 差异片段的回收与再扩增
• 1.7 差异片段的克隆
• 1.7.1 DH5α感受态细胞的制备
• 1.7.2 连接
• 1.7.3 转化
• 1.7.4 质粒筛选
• 1.7.5 插入片段鉴定
• 1.8 差异片段的序列分析（Dot Blot 杂交）
• 1.9 Dot Blot 杂交
• 1.9.1 探针标记
• 1.9.2 预杂交
• 1.9.3 杂交
• 1.9.4 洗膜
• 1.9.5 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA完整性检测
• 2.2 银染差异显示条件的优化
• 2.3 mRNA差异显示
• 2.4 差异片段的再扩增与产物回收
• 2.5 阳性克隆的 PCR 鉴定
• 2.6 序列分析与比对
• 2.7 Dot-blot 检测所扩片断的假阳性
• 3 讨论
• 4. 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录