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新型纳米DNA转运体系的构建及其在软骨损伤治疗等方面的应用研究

2020-12-07阅读(958)

新型纳米DNA转运体系的构建及其在软骨损伤治疗等方面的应用研究

论文摘要

目的通过对高分子量壳聚糖进行控制性降解,使其成为低分子量壳聚糖,构建一种新型的纳米基因传送系统,能够在体内外安全高效地进行基因传递,表征其理化性质,为关节软骨损伤提供简便有效的治疗措施。研究纳米局部转运系统（Nanometer Local Delivery System, NLDS）在体内外的转运机制,评估局部的基因表达量及基因转染的持续性、安全性、有效性、可控性。检测其生物学特性。分离、培养、冻存、复苏和传代兔关节软骨细胞。评估该系统体内外转染软骨细胞的效果,以及对软骨缺损的动物模型的转染效果。探索体内外应用纳米局部转运系统传递生长因子基因来促进软骨损伤修复的条件和方法,并根据体外的实验数据进行必要的条件优化,进而利用其携带生长因子基因对软骨缺损的动物模型进行转染,促进软骨修复。同时,将其与抗TNF的反义核酸技术结合,对其在假体无菌性松动和类风湿关节炎的应用进行探索性研究。方法采用NaNO2氧化法降解,将HMWC降解为合适分子量的LMWC,以FITC标记壳聚糖后,用凝胶渗透层析（GPC）的方法测定壳聚糖的分子量。以Xylidine Tonceau 2R （C.I. Acid Red 26）为指示剂的比色滴定法测定氨基百分含量。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒、β-半乳糖酐酶（β-Galactosidase）、TGF-β1质粒等作为目的基因,通过分子自组装的方法制备载基因纳米壳聚糖微粒。以透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察微粒的形态,以激光粒径分析仪测定其粒径和表面的Zeta电位,行DNaseⅠ酶切保护实验研究壳聚糖对质粒DNA的保护作用,行MTT试验研究纳米微粒对细胞的毒性作用。对体外培养的关节软骨细胞进行转染,评估该系统体外转染软骨细胞的效果;切取软骨组织薄片体外行组织培养,评价该系统对软骨组织体外转染的效果;在兔膝关节上复制关节软骨缺损的模型,用该系统携带生长因子基因对软骨缺损的动物模型进行转染,观察其促进软骨修复的效果,同时观察该目的基因表达的时空及丰度特征等指标。在体内转染的同时,对其安全性进行评估。另外,采用ICR小鼠建立磨损微粒诱导的骨溶解的动物模型,采用该系统给药,观察其在假体无菌性松动应用方面的效果。采用DBA1小鼠建立II型胶原诱导的类风湿关节炎模型,同样采用该系统给药,观察其抗类风湿方面的效果。结果随着与NaNO2反应时间增加,从GPC测定中得到的壳聚糖的分子量从145kD降到了18kD。相应地,通过比色滴定得到的各种壳聚糖的-NH2百分含量也从71%降低到了51%。壳聚糖可以和GFP质粒相互作用形成带有表面正电荷的纳米微粒,TEM和AFM观察到的纳米微粒的形状是近似球形的,大小较均一,表面光滑,粒径在70nm左右。该系统能在很大程度上保护质粒DNA不受DNaseⅠ的降解,对细胞的毒性小。体外对培养的软骨细胞的定性和定量转染均显示该系统有良好的转染特性;对体外培养的软骨组织转染结果与细胞转染结果相近;在体内时应用,LMWC/ TGF-β1基因纳米复合物可以提高目的基因的转移效率和延长相应蛋白的表达时程,目的基因表达的时程和分布特征良好,在软骨缺损动物模型的应用中取得了良好的治疗效果。该系统携带靶向TNF-α的ASO进行基因传递用于干预微粒诱导的骨溶解模型时,可抑制小鼠颅骨局部植入Co-Cr-Mo合金后TNF-α的mRNA的转录上调,与此同时TNF-α的蛋白定量测定也相应的下降,对应的破骨细胞数量,TRAP定量结果,以及骨吸收陷窝的数量,均有所下降。而且这种改变在再次给予了TNF-α后可以逆转。该系统携带靶向TNF-α的ASO进行基因传递用于干预II型胶原诱导的类风湿关节炎模型时,可以抑制造模小鼠的体重下降,明显缓解小鼠后足垫和前足腕部的肿胀,X线结果和功能学观察也表明该系统对类风湿关节炎具有明显的抑制作用。结论高分子量（HMWC）降解而成的低分子量壳聚糖（LMWC）具有很好的溶解性,对细胞基本无毒,在生理环境下可以有效结合质粒DNA和反义核酸药物,形成稳定存在的纳米复合物颗粒。基于LMWC的纳米核酸药物传输系统对软骨细胞在体内外均有良好的转染效率。在体外能够保护目的DNA并延长其作用时间,在体内则对软骨缺损区域表现出一定的被动靶向性,更易于在缺损附近进行转染。使用该系统携带TGF-β1质粒应用于兔关节软骨缺损模型,能够有效地表达治疗因子,促进软骨修复。使用该系统携带抗TNF-α的反义核酸（ASO）,应用于假体无菌性松动的动物模型中,可以有效地抑制小鼠模型中由微粒诱导的骨溶解。使用该系统携带抗TNF-α的反义核酸（ASO）,应用于鸡胶原诱导的类风湿关节炎（RA）模型,可以有效地缓解RA的病情,抑制病情的发展。载基因低分子量壳聚糖纳米微粒能够有效地输送目的DNA,是一个很有潜力的纳米局部传输系统（Nanometer Local Delivery System, NLDS）。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一部分 概述
  • 一、纳米医学与基因治疗
  • 1. 纳米医学的定义
  • 2. 纳米医学的应用
  • 3. 基因治疗
  • 4. 纳米医学在基因治疗领域内的应用
  • 5. 壳聚糖作为DNA载体的研究进展
  • 二、研究背景
  • 三、研究目的、意义、思路、步骤及内容
  • 1、研究目的
  • 2、研究意义
  • 3、基本思路
  • 4、研究步骤及内容
  • 参考文献
  • 第二部分 纳米基因转移系统的制备和表征
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2.LMWC的制备及FITC的标记
  • 3.LMWC分子量和氨基百分含量的测定
  • 4. 质粒的扩增和纯化
  • 5.DNA纳米微粒的复合制备
  • 6.DNA纳米微粒的形态学观察
  • 7.DNA纳米微粒的平均粒径和Zeta电位的测定
  • 8. 酶切保护试验
  • 二、主要实验结果
  • 1.LMWC的制备及FITC的标记
  • 2.LMWC分子量和氨基百分含量的测定
  • 3. 质粒的扩增和纯化
  • 4.DNA纳米微粒的表观特征
  • 5. 酶切保护试验结果
  • 参考文献
  • 第三部分 兔关节软骨细胞的分离培养与冻存复苏
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 软骨细胞的分离获取
  • 3. 软骨细胞的原代及传代培养
  • 4. 关节软骨细胞的冻存与复苏
  • 5. 细胞计数法绘制细胞增殖曲线
  • 6. 软骨细胞的GAGs组织化学染色
  • 二、主要实验结果
  • 1. 软骨细胞的分离获取
  • 2. 倒置显微镜观察
  • 3. 细胞增殖曲线
  • 4. 细胞组织化学染色结果
  • 参考文献
  • 第四部分 载基因低分子量壳聚糖纳米微粒体外转染特性研究
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 体外报告基因转染软骨细胞试验
  • 3. 体外报告基因转染软骨组织块试验
  • 4. 体外对软骨细胞的细胞毒性试验
  • 二、主要实验结果
  • 1. 体外报告基因转染软骨细胞试验的结果
  • 2. 体外报告基因转染软骨组织块试验的结果
  • 3. 体外对软骨细胞的细胞毒性试验的结果
  • 参考文献
  • 第五部分 载基因低分子量壳聚糖纳米微粒体内转染特性研究
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 全层软骨缺损的动物模型
  • 3. 体内报告基因转染软骨细胞试验
  • 4. 安全性评价
  • 5. 体内生长因子基因转染软骨细胞试验
  • 二、主要实验结果
  • 1. 动物模型一般情况
  • 2. 体内报告基因转染软骨细胞结果
  • 3. 安全性评价
  • 4. 体内生长因子基因转染软骨细胞的结果
  • 参考文献
  • 第六部分 新型纳米非病毒基因转运系统治疗软骨缺损的研究
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 体内动物模型转染修复软骨缺损的实验
  • 二、主要实验结果
  • 1. 动物模型一般情况
  • 2. 体内动物模型转染转染治疗软骨缺损的结果
  • 参考文献
  • 第七部分 纳米DNA传输系统在假体无菌性松动模型中的应用
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 载ASO纳米复合物颗粒的制备
  • 3.Co-Cr-Mo 合金粉末处理
  • 4. 磨损微粒诱导的骨溶解动物模型的建立
  • 5. 实验分组与给药
  • 6. 载ASO的纳米微粒原位转染抑制骨溶解的研究
  • 二、主要实验结果
  • 1. 动物模型一般情况
  • 2. 复合物对TNF-α表达的抑制作用
  • 3. 破骨细胞TRAP染色和TRAP定量
  • 4. 骨吸收陷窝的观察和积分
  • 5.TNF-α再次给予实验
  • 参考文献
  • 第八部分 纳米DNA传输系统在类风湿关节炎模型中的应用
  • 一、实验方法
  • 1. 实验材料
  • 2. 载ASO纳米复合物颗粒的制备
  • 3. 类风湿关节炎解动物模型的建立
  • 4. 实验分组与给药
  • 5. 载ASO的纳米微粒原位转染治疗类风湿关节炎的研究
  • 二、主要实验结果
  • 1. 动物模型一般情况
  • 2. 纳米DNA传输系统在类风湿关节炎中的应用
  • 参考文献
  • 第九部分 讨论
  • 一、新型纳米非病毒基因转运系统治疗软骨缺损的研究
  • 1. 软骨的损伤与修复
  • 2. 软骨缺损的动物模型
  • 3.TGF-β1 与软骨修复
  • 4. 基因治疗与软骨修复
  • 5. 降解后的壳聚糖作为基因载体
  • 6. 针对关节软骨和关节内环境的考量
  • 二、纳米DNA传输系统在假体无菌性松动模型中的应用
  • 1.TNF-α与假体松动
  • 2. 抗TNF-α治疗与假体松动
  • 3. 抗TNF-α的ASO
  • 4. 抗TNF-α的ASO 抑制微粒诱导的骨溶解
  • 三、纳米DNA传输系统在类风湿关节炎模型中的初步应用
  • 1.TNF-α与RA
  • 2. 抗TNF-α的生物制剂与RA的治疗
  • 3. 抗TNF-α治疗的安全性与有效性
  • 4. 抗TNF-α的ASO 治疗RA
  • 参考文献
  • 文献综述一
  • 参考文献
  • 文献综述二
  • 参考文献
  • 文献综述三
  • 参考文献
  • 文献综述四
  • 参考文献
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢

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