利用双右边界（DRB）双元载体系统和MAS技术改良水稻白叶枯病抗性的研究

论文摘要

水稻是一种重要的粮食作物,白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo.）是水稻的主要病害之一,控制这种病害最经济有效的方法是将白叶枯病抗性基因导入其栽培品种。目前最常用的外源基因导入方法是根癌农杆菌介导的遗传转化和分子标记辅助选择技术（Molecular marker-assisted selection,MAS）。Xa21基因是从水稻中分离并克隆的第一个抗病基因,对白叶枯病具有广谱抗性。Xa23基因是章琦等从我国普通野生稻中鉴定发掘出来的显性抗白叶枯病基因,对国内外所有鉴别菌系都表现为高抗,全生育期抗病。 目前农杆菌介导的籼稻转化体系并不完善,本研究对蜀恢527、绵恢725、创恢11、培矮64S、D62B和9311等6个籼稻品种的幼胚和成熟胚愈伤组织的诱导与再生条件进行了研究,其结果显示,MS培养基比CC培养基更适合籼稻幼胚和成熟胚愈伤组织的诱导,但CC培养基比MS培养基更适合成熟胚愈伤组织的继代培养,在CC培养基上繁殖的愈伤组织不易褐化,且胚性更好;MS培养基比CC培养基更适合用于幼胚和成熟胚愈伤组织的筛选与抗性愈伤组织的分化;籼稻出愈率与甘露醇的浓度密切相关,随着甘露醇浓度的降低而增加;幼胚诱导获得的愈伤组织颜色、质地和对潮霉素（Hyg）耐受性都优于成熟胚获得的愈伤组织,生长速度和分化出苗率都高于成熟胚获得的愈伤组织。但是,幼胚受取材时间的限制,不能获得大批量的愈伤组织。 籼稻对Hyg的敏感性试验发现,不同基因型对Hyg的敏感性不同,而且同一品种在不同培养基上对Hyg的抗性也不同,几乎所有的品种在MS筛选培养基上的对Hyg的抗性比在CC筛选培养基上的抗性低。籼稻在分化过程中,对Hyg最为敏感,只要在分化培养基上添加20mg/L的Hyg就足以将转化细胞与非转化细胞区分开,在壮苗生根培养阶段,15mg/L的Hyg浓度是合适的筛选浓度。 共培养过程中细菌的状态和浓度对转化效率的影响很大。如果菌液浓度过高,菌体本身易相互聚结,从而影响其在外植体上的附着;浓度过低时,不利于基因的转入。本试验研究结果表明,共培养所用农杆菌苗液的OD600=0.2左右为宜,在这种浓度下,使用250mg/L Cb+250mg/L Cef可以完全有效地控制农杆菌。 利用双右边界（double right—border,DRB）的双元载体(hpt标记基因位于两

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词（ABBREVIATION）
• 1 文章综述
• 1.1 水稻抗白叶枯病基因的研究进展
• 1.1.1 水稻对白叶枯病的抗性研究与抗性基因的鉴定
• 1.1.2 水稻对白叶枯病抗性基因的定位与克隆
• 1.2 农杆菌介导植物转化技术和利用分子标记辅助选择育种的研究进展
• 1.2.1 农杆菌介导植物转化技术在禾本科植物中的应用
• 1.2.2 遗传转化中生物安全标记基因和无选择标记基因研究进展
• 1.3 水稻抗白叶枯病分子标记辅助选择育种的研究进展
• 1.4 论文选题的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试水稻品种
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 适合电激转化感受态细胞的制备
• 2.2.2 电激转化
• 2.2.3 菌株的保存
• 2.2.4 外植体的培养及农杆菌的遗传转化
• 2.3 水稻抗性植株的检测
• 2.3.1 PCR检测
• 2.3.2 SOUTHERN BLOT检测
• 2.3.3 抗性检测
• 2.4 获得无标记基因转基因植株技术路线
• 2.5 分子标记辅助选择程序
• 2.5.1 RM206标记准确性验证
• 2.5.2 选择程序
• 2.5.3 白叶枯接种及抗性分析
• 2.5.4 杂交组合配制及异地同步选择
• 3 结果与分析
• 3.1 籼稻转化再生体系的优化与建立
• 3.1.1 不同基因型籼稻各发育阶段对潮霉素敏感性试验
• 3.1.2 培养基对籼稻成熟胚愈伤组织诱导、继代、筛选和分化的影响
• 3.1.3 菌液浓度对转化效率的影响
• 3.1.4 优化的籼稻农杆菌转化体系的建立
• 3.2 转基因植株的分析
• 3.2.1 转基因植株的获得及其后代检测
• 3.2.2 转基因植株的T0代检测
• 3.2.3 转基因植株的T1代检测
• 3.2.4 转基因植株T2代的检测
• 3.2.5 转基因植株T3代的检测
• 3.2.6 SOUTHERN BLOT验证
• 3.3 分子标记辅助选择
• 3.3.1 RM206标记的准确性验证
• 3.3.2 RM206选择结果分析
• 4 结论
• 4.1 农杆菌介导的籼稻转化体系的建立与优化
• 4.2 农杆菌介导的籼稻转化体系获得XA21转基因植株
• 4.3 分子标记辅助选择获得的转Xa23基因植株
• 5 讨论
• 5.1 水稻愈伤组织诱导和再生体系的优化
• 5.2 农杆菌介导水稻愈伤组织转化体系的优化
• 5.2.1 不同菌液浓度的农杆菌对转化效率的影响
• 5.2.2 培养基对转化效率的影响
• 5.2.3 基因型与转化效率的关系
• 5.3 基因沉默
• 5.4 利用双右边界双元载体系统与去除标记基因的其它方法的比较
• 5.5 MAS实施中分子标记的选择及利用
• 5.6 MAS育种程序的建立
• 5.7 传统育种和分子标记辅助选择的有机结合
• 参考文献
• 致谢
• 附录Ⅰ 试验使用仪器药品名称型号及生产厂家
• 硕士期间发表的论文