梓醇对慢性脑缺血大鼠脑白质保护作用的实验研究

论文摘要

随着影像技术的发展尤其是磁共振在临床的广泛应用,老年人不同病因脑白质病变的检出率越来越高。老年人脑白质损伤与认知功能障碍、步态及平衡能力损害、痴呆等有着密切的联系,严重影响着人类的健康水平。虽然脑白质损伤的发病机制目前尚未得到充分阐明,但目前研究认为慢性脑缺血是脑白质损伤的重要原因,常伴发于动脉硬化、血管性痴呆、Alzheimer病等多种脑血管疾病的病理过程中。因此,深入研究慢性脑缺血发生的病理生理机制,寻找慢性脑缺血治疗的新靶点并开发相应的药物有重要意义。传统观点认为脑白质对缺血具有很高的耐受性,这一观点影响着对脑缺血后胶质细胞改变及机制的研究。但最近研究发现慢性脑缺血的组织病理学改变主要是以脑白质的损害为特征,其病理改变主要表现为:小胶质细胞和星形细胞增生活化、少突胶质细胞减少、轴突变性、脱髓鞘和脑白质疏松等。增生活化的星形胶质细胞和小胶质细胞是炎性因子的主要来源,其介导的炎症反应可促进脑白质少突胶质细胞的调亡和髓鞘损伤,因此抑制炎性胶质细胞的增生活化则可拮抗脑白质的缺血性损伤。少突胶质细胞是脑白质的主要组成细胞,也是中枢神经系统的髓鞘形成细胞,对缺血同样具有较高的敏感性,慢性、轻微、持续性脑缺血时少突胶质细胞较神经元更易受损。因此,少突胶质细胞作为缺血时脑白质损伤的重要原因,正在受到更多的重视。目前针对脑缺血损伤的因素,大量的化合物在动物模型上已取得喜人疗效,但临床大规模的实验结果却令人失望。近年来有关中药对脑缺血治疗的研究也取得快速的发展。中药因其具有毒副反应小、作用缓和持久、疗效稳定可靠等特点,在预防和治疗脑血管疾病方面显示出一定的优越性。梓醇为地黄的主要有效活性成分之一,具有利尿、缓泻、降血糖及保肝等药理作用。梓醇在体内外实验中均具有抑制神经细胞调亡的作用,已有的研究还显示梓醇有抗炎症、抗氧化、拮抗细胞内Ca2+活性的功能,而炎症、氧化作用、细胞内Ca2+超载都是细胞调亡的重要启动因素,由此推测梓醇有可能作为一种神经保护剂通过作用于调亡级联反应过程中多个不同位点而发挥其抗调亡功效。此外,梓醇可提高老年大鼠海马的神经可塑性,促进PC12细胞的分化,表明梓醇具有促进神经修复的潜能。梓醇这种具有神经保护和促神经修复的双重作用,使其有可能成为脑缺血损伤治疗的理想药物。但之前关于梓醇对脑缺血的作用研究,多集中在其对急性脑缺血神经元的保护上,对慢性脑缺血少突胶质细胞的保护尚未见文献报道。由于脑缺血后的神经功能障碍是全脑性的,从脑缺血后神经功能恢复的角度来看,不仅要保护灰质的神经元,还要保护白质的少突胶质细胞,因此有必要进一步研究梓醇对脑缺血损伤后少突胶质细胞的保护作用。Akt信号通路是重要的促细胞存活信号转导通路,该通路能够抑制多种刺激所致的细胞凋亡,维持细胞存活。之前研究发现梓醇在沙土鼠脑缺血再灌注模型中可通过提高Bcl-2的蛋白表达水平来促进神经元的存活,说明梓醇的保护作用可能与Akt信号通路有关。另有文献报道,p-Akt介导的Bcl-2上调对于少突胶质细胞的存活也具有重要作用。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）是p-Akt的下游信号分子,CREB被p-Akt磷酸化后成为活性CREB（即p-CREB）,p-CREB又可促进下游分子Bcl-2的转录,进而调节细胞的存活。现已证实p-CREB也可通过上调Bcl-2的表达来抑制慢性脑缺血诱导的少突胶质细胞调亡和脑白质损伤。由此可见Akt信号通路介导的抗调亡效应对于少突胶质细胞的存活具有重要作用。那么,梓醇对于少突胶质细胞的保护作用是否与Akt信号通路有关呢?目前尚不清楚。为了进一步研究梓醇对脑白质的保护作用与Akt信号通路的相关性,我们拟通过永久性结扎大鼠双侧颈总动脉建立慢性脑缺血模型,应用HE染色、LFB染色、透射电镜、免疫组化、Western Blot等技术方法观察梓醇对脑白质损伤的治疗效果并对其作用机制进行初步探讨。主要结果如下:1.慢性脑缺血对大鼠脑白质损伤的影响HE染色显示:在脑缺血不同时间点可观察到脑白质不同程度的病理学改变,包括白质疏松,纤维排列凌乱,空泡样改变,出现软化灶等。随缺血时间的延长,脑白质囊泡面积逐渐增加,在总测定面积中所占比例逐渐增大。LFB染色、MBP免疫组化和Western blot的结果显示:随脑缺血时间的延长,髓鞘病变逐渐明显,髓鞘崩解范围扩大,部分髓鞘呈空泡状,LFB和MBP染色的平均光密度值以及MBP的蛋白表达水平逐渐下降。这说明慢性脑缺血可诱导脑白质的髓鞘损伤。APC、Caspase-3免疫组化、TUNEL染色和Western blot的结果显示:随缺血时间延长,脑白质APC阳性的少突胶质细胞数逐渐减少,TUNEL和Caspase-3阳性的调亡细胞数及Caspase-3蛋白的表达水平逐渐增加。这提示慢性脑缺血可诱导脑白质少突胶质细胞的调亡。GFAP、ED1免疫组化和TNF-α的Western blot结果显示:脑缺血后,GFAP阳性的星形胶质细胞和ED1阳性的小胶质细胞胞体增大、突起增多,两者细胞数在缺血14d至90d明显增加;TNF-α在胼胝体的蛋白表达水平随缺血时间延长而逐渐增加。这表明慢性脑缺血可诱导炎症反应的发生,而炎症反应可能介导了脑白质的损伤。2.梓醇对慢性脑缺血大鼠脑白质的保护作用APC、MBP免疫组化和透射电镜的结果显示:梓醇对正常大鼠脑白质的少突胶质细胞数、髓鞘染色的平均光密度值及髓鞘的超微结构无明显影响。LFB染色、MBP免疫组化、透射电镜和Western blot的结果显示:梓醇治疗后可显著提高缺血大鼠脑白质髓鞘染色的平均光密度值、提高MBP的蛋白表达水平、缓解髓鞘的损伤。这表明梓醇对脑白质缺血损伤的髓鞘具有保护作用。APC、Caspase-3免疫组化、TUNEL染色和Western blot的结果显示:梓醇治疗后可明显增加缺血大鼠胼胝体的少突胶质细胞数、抑制少突胶质细胞的调亡。这说明梓醇对脑白质的保护作用与其抗调亡效应有关。PDGFR-α免疫组化的结果显示:缺血后脑白质的少突胶质前体细胞数明显增加,而梓醇治疗组胼胝体增多的成熟少突胶质细胞数又明显多于仅由凋亡减少而增加的成熟少突胶质细胞数,表明部分新增的成熟少突胶质细胞数可能来源于分化的少突胶质前体细胞。但梓醇的促分化作用仍需进一步研究证实。GFAP、ED1免疫组化和TNF-α的Western blot结果显示:梓醇治疗后可明显的降低脑白质星形胶质细胞和小胶质细胞的增生活化,抑制炎症因子的释放。这提示梓醇对脑白质的保护作用与其抗炎症效应有关。3.梓醇对慢性脑缺血脑白质中Bcl-2、p-Akt和p-CREB表达的影响Bcl-2、p-Akt和p-CREB免疫组化结果显示:慢性脑缺血后,胼胝体Bcl-2、p-Akt和p-CREB阳性的细胞数有少量增加,但与假手术组比较无明显差异。梓醇治疗后,可明显提高胼胝体Bcl-2、p-Akt和p-CREB阳性细胞数,增加Bcl-2和p-Akt在少突胶质细胞的表达。这说明梓醇对少突胶质细胞的保护作用可能与Akt信号通路有关。Bcl-2、p-Akt和p-CREB的Western blot结果显示:慢性脑缺血后,胼胝体Bcl-2、p-Akt和p-CREB的蛋白表达水平有少量增加,但与假手术组比较无显著性差异。梓醇治疗后,可明显提高胼胝体Bcl-2、p-Akt和p-CREB的表达水平。这进一步说明Akt信号通路可能介导了梓醇对慢性脑缺血脑白质的保护作用。综上所述,本研究通过结扎大鼠双侧颈总动脉建立的慢性脑缺血模型,可造成脑白质不同程度的病理学改变,包括髓鞘损伤、少突胶质细胞调亡、星形胶质细胞和小胶质细胞增生活化等,应用梓醇治疗可明显减轻上述脑白质的病理学改变。此外,梓醇还可提高慢性脑缺血脑白质Bcl-2、p-Akt和p-CREB的表达水平,提示梓醇对脑白质的保护作用可能与Akt信号通路介导的抗凋亡、促分化效应有关。因此,梓醇有望成为治疗慢性脑缺血诱导的脑白质损伤的有效治疗药物,本研究为寻找慢性脑缺血的预防和治疗靶点提供一定的基础实验资料。

论文目录

• 常用英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 总前言
• 参考文献
• 总材料和方法
• 第一部分 慢性脑缺血对大鼠脑白质损伤的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 梓醇对慢性脑缺血大鼠脑白质的保护作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 梓醇保护慢性脑缺血脑白质作用机制的初步研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 文献综述一 少突胶质细胞的缺血性损伤
• 参考文献
• 文献综述二 梓醇在神经系统作用的研究进展
• 参考文献
• 攻读博士期间发表论文