肝脏再生调控相关转录因子间相互作用网络的初步研究

论文摘要

肝脏是人类少数具有再生能力的器官之一,肝脏再生是生物体进化而来的一种自我保护措施。目前对于肝脏再生研究表明,肝脏再生过程可以分为三个阶段,即启动、再生与终止,但这三个阶段的发生、发展机制均尚未被彻底阐明。对于肝脏再生的认识也经历了三个过程,首先人们认为肝脏再生过程是以某一个蛋白因子为开关,一旦触动这个开关,肝脏再生过程就按照设计好的程序依次展开,直到再生完成而终止;后来人们认识到这个过程的复杂性,不是某一个蛋白能够决定的,而是某一条通路起到关键作用,但是事实上依然解释不了这个过程中的众多谜团;最后,人们认识到肝脏再生远比想象的还要复杂,它是一个多条信号通路参与、相互影响、相互作用的最终结果。在上述不同阶段的理论指导下,以往对于肝脏再生的研究都集中在某一个或几个单独的细胞因子或通路,而近来的研究则更注重宏观层面的研究,试图从全基因组来认识这个现象。本文在这种研究背景之下,采用酵母双杂交的方法绘制了肝脏再生过程中相关转录因子的蛋白相互作用图谱,试图从蛋白质互作网络的整体水平揭开肝脏再生的秘密。本文研究内容及结果主要包括以下几个方面:1肝脏再生过程中转录因子的筛选:首先,在全基因组水平筛选调控肝脏肿瘤细胞株SMMC7721生长的重要基因,共筛选了29,910个ORFs对细胞生长的刺激或抑制作用。通过单个ORF转染SMMC7721细胞,发现一批能够控制细胞生长的因子,其中包括129个转录因子。同时,本实验室还采用小鼠CCl4导致肝损伤的模型,以gene chip? mouse 430 2.0芯片检测了肝损伤过程中mRNA水平的基因表达谱。以芯片数据分析即mRNA的表达水平变化,以及上述细胞生长筛选出的129个转录因子为基础,选择了32个既能够刺激或抑制肝癌细胞生长,又在肝脏再生过程有表达量上调或下调的变化的ORFs,包括27个转录因子和5个磷酸激酶。经过这两个条件筛选,选择的32个ORFs编码蛋白与肝脏再生的调控被认为密切相关。2转录因子相互作用网络的绘制:首先,将32个ORFs分别克隆到载体pGADT7（AD）和pGBKT7（BD）,然后分别转化到酵母株AH109与Y187,经氨基酸缺陷培养基筛选阳性克隆后,分别得到32个“诱饵”和“猎物”蛋白。第二步将每一个“诱饵”蛋白与每一个“猎物”蛋白进行报告基因自激活检测,共发现三个“诱饵”蛋白和两个“猎物”蛋白即BD-HBP1、BD-STAT3、BD-FOXM1、AD-FOXM1、AD-REA具有自激活能力,故这几个“诱饵”和“猎物”蛋白被排除在下一步一对一矩阵杂交之外;通过870次酵母双杂交-矩阵杂交实验,采用HIS3、LacZ、ADE2三个报告基因的平行测试,共发现64对相互作用,即至少激活一个报告基因的表达,依据对报告基因激活程度的鉴定又将这些相互作用按照强度分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四类,共得到18对Ⅰ级、9对Ⅱ级、21对Ⅲ级和16对Ⅳ级相互作用,最后运用这些数据绘制出一张与肝脏再生相关转录因子间的蛋白互作网络图。3转录因子相互作用网络质量的验证:为了验证蛋白互作网络的可靠性和真实性,采用与其它蛋白互作图谱比较、体外结合试验以及β-半乳糖苷酶活性定量测定的办法检验了该网络的质量。通过与其它蛋白互作图谱对比发现,选择的32个ORFs中多个没有被提及,但是结果与已发表的结果相比有很高的相似性;通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）与谷光苷肽巯基转移酶沉淀试验（Glutathionine-S-transferase Pull-down, GST Pull-down）对通过酵母双杂交获得的64对相互作用中的13对进行进一步验证。将这13对互作的ORFs克隆到真核表达与原核表达载体,分别在大肠杆菌和HEK293T细胞中进行表达,然后运用Co-IP和GST Pull-down方法,证实了其中11对相互作用;采用β-半乳糖苷酶活性定量测定的办法不仅再一次验证了互作,还量化了相互作用激活报告基因的程度。通过以上实验,证实了酵母双杂交所获得的相互作用的基本可靠性,以及由此绘制出的肝脏再生过程中转录因子互作网络的真实可靠性。4转录因子相互作用网络在肝脏再生过程中的作用分析:对于肝脏再生过程中转录因子间的蛋白相互作用网络的研究,其最终目的是为了进一步深化对肝脏再生的理解。本文通过分析肝脏再生过程中与STAT3和ATF3可能发生互作的所有蛋白以及该两种转录因子在肝脏再生过程的作用,把STAT3和ATF3作为调控肝脏再生蛋白互作网络研究的切入点,并推测FHL2-ATF3和FHL2-STAT3的互作在肝脏再生过程中起到抑制再生的作用;鉴于32个ORFs大多数都具有抑制肝癌细胞增值的功能,并且绝大多数互作蛋白对中至少有一个蛋白具有抑制肝癌细胞生长的特性。因此,我们绘制的网络可能起到抑制肝脏再生的作用。FHL2与ATF3之间的相互作用,是本论文首次发现的,它可能在调控肝脏再生后期结束再生的过程中担任重要角色,目前这对相互作用在体内的验证工作正在进行中。5转录因子相互作用网络的后续研究:寻找相互作用结构域是研究蛋白互作的常用及有效方法。本研究中发现,有多个转录因子,如FHL2、ZNF408、ID3与ZNF212等,能够与众多蛋白发生互作,在网络中处于核心地位,即所谓的Hub蛋白。所以本文对其中的FHL2-ATF3、ZNF408-ZNF408这两对作用位点进行了深入研究。实验结果表明FHL2与ATF3这对相互作用中,FHL2的第一个结构域（即半个Lim）起主要的作用,而ATF3的转录激活结构域和抑制结构域均起到了作用;在ZNF408的自作用中,ZNF408中间的锌指重复序列起到了关键作用;为了扩大PPI网络的信息量,用DLK和FP248筛选了人肝脏cDNA文库,得到近700个克隆,待下一步测序验证互作的蛋白。综上所述,本文采用酵母双杂交系统构建了一个与肝脏再生相关的调控肝细胞增殖转录因子间的蛋白互作网络;通过多种实验手段对网络的质量进行了验证;提出了蛋白互作网络对肝脏再生的调控机制;对转录因子相互作用网络后期的深入研究进行了初步探索;本研究为转录因子相互作用网络的生理活性研究奠定了基础,为肝脏蛋白质组学的研究提供了崭新的思路,初步为我们最终理解肝脏再生机理提供了科学依据。

论文目录

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英文摘要

缩略语及中英文对照表

第一章绪论

1.1 肝脏再生研究进展

1.1.1 普罗米修斯的传说

1.1.2 肝脏再生

1.1.3 从分子生物学角度理解肝脏再生

1.1.4 肝脏再生机理认识

1.1.5 小结

1.2 蛋白质相互作用研究概述

1.2.1 酿酒酵母生活史

1.2.2 酵母双杂交系统的基本原理

1.2.3 酵母双杂交系统的改进

1.2.3.1 双（多）筛选法

1.2.3.2 非转录读出特点的酵母双杂交系统

1.2.3.3 哺乳动物细胞双杂交系统

1.2.3.4 单杂交系统

1.2.3.5 逆向酵母双杂交和分裂杂交系统

1.2.3.6 三杂交系统

1.2.4 酵母双杂交系统的优点

1.2.5 酵母双杂交系统的缺陷及相应对策

1.2.5.1 核内作用

1.2.5.2 假阳性

1.2.5.3 假阴性

1.2.5.4 转化率

1.2.6 酵母双杂交系统的应用

1.2.6.1 检测已知蛋白质之间的相互作用

1.2.6.2 确定蛋白质之间相互作用的重要活性位点

1.2.6.3 寻找与“诱饵”蛋白之间的相互作用的未知蛋白

1.2.6.4 寻找基因治疗中多肽类药物

1.2.6.5 寻找调控蛋白相互作用的化合物

1.2.6.6 蛋白质相互作用图谱的绘制

1.2.7 小结

1.3 大规模蛋白质相互作用研究的现状及局限性

1.4 本论文的研究目的、内容和意义

第二章材料与方法

2.1 质粒、载体、菌株、细胞株和抗体

2.2 仪器设备

2.3 DNA 相关实验方法

2.3.1 聚合酶链式反应

2.3.2 琼脂糖电泳

2.3.3 酶切试验

2.3.4 载体、片段凝胶回收试剂盒回收

2.3.5 载体、片段的PCR 产物片段试剂盒回收

2.3.6 连接试验

2.3.7 质粒构建方法

2.3.8 转化试验

2.3.9 质粒抽提

2.3.9.1 质粒小量抽提操作过程

2.3.9.2 SDS-碱裂解法中量制备质粒DNA

2.4 细菌试验方法

2.4.1 培养基配制

2.4.2 感受态大肠杆菌制备

2.4.3 菌种的保存方法

2.4.3.1 长时间保存

2.4.3.2 短时间保存

2.5 蛋白相关实验

2.5.1 蛋白表达方法

2.5.1.1 小量初试操作方法

2.5.1.2 中量诱导表达蛋白

2.5.2 蛋白检测-SDS-PAGE 电泳

2.5.3 Western Blot

2.5.4 蛋白抽提及复性

2.5.5 蛋白纯化

2.5.5.1 6×His 亲和层析

2.5.5.2 GST 亲和层析

2.5.6 GST Pull-down assay

2.5.7 免疫共沉淀（Co-IP assay）

2.6 酵母试验方法

2.6.1 培养基配制

2.6.2 醋酸锂介导的酵母转化方法

2.6.3 酵母杂交

2.6.4 酵母表型筛选

2.6.5 β-半乳糖苷酶活性测定

2.6.6 酵母质粒提取

2.6.7 cDNA 文库的操作

2.6.8 筛cDNA 文库

2.7 细胞试验材料和方法

2.7.1 胎牛血清的处理

2.7.2 细胞DMEM/RPMI 1640 培养基配制

2.7.3 细胞复苏

2.7.4 细胞换液

2.7.5 细胞传代

2.7.6 细胞保种

2.7.7 细胞计数

2.7.8 细胞转染

2.7.9 细胞裂解方法（以100cm 培养皿为例）

第三章结果与讨论

3.1 肝脏再生转录因子互作网络的绘制

3.1.1 前言

3.1.2 转录因子挑选结果

3.1.3 亚克隆

3.1.4 自激活的测试结果

3.1.5 杂交菌种的准备

3.1.6 矩阵杂交

3.1.7 小结

3.1.8 讨论

3.2 网络质量的验证

3.2.1 前言

3.2.2 文献查阅验证

3.2.3 Bait 和Prey 融合标签蛋白的原核表达

3.2.3.1 原核表达载体的构建

3.2.3.2 原核表达载体的构建

3.2.3.3 目的蛋白原核表达结果

3.2.3.4 GST Pull-down

3.2.4 Bait 和Prey 融合标签蛋白的真核表达结果

3.2.4.1 真核表达载体的改造

3.2.4.2 真核表达载体的构建

3.2.4.3 目的蛋白真核表达结果

3.2.4.4 Co-IP 结果

3.2.5 β-半乳糖苷酶活性测定

3.2.5.1 方法学试验

3.2.5.2 阳性对照在不同菌株、不同转化条件下的活性

3.2.5.3 野生型GAL4 激活的β-半乳糖苷酶活性

3.2.5.4 本底活性测定结果

3.2.6 部分重要相互作用的β-半乳糖苷酶活性的测定

3.2.6.1 二倍体内的相互作用

3.2.6.2 Y187 菌株中的相互作用

3.2.7 互作网络的作图

3.2.8 小结

3.2.9 讨论

3.3 相互作用网络作用分析

3.3.1 前言

3.3.2 FHL2 /ATF3 互作的意义

3.3.3 FHL2 /STAT3 互作的意义

3.3.4 网络的整体作用分析

3.3.5 小结

3.3.6 讨论

3.4 肝脏再生调控转录因子互作网络的后期研究

3.4.1 前言

3.4.2 缺失突变体的Y2H 载体构建

3.4.2.1 ATF3 蛋白的分段引物设计

3.4.2.2 FHL2 蛋白分段引物设计

3.4.2.3 ZNF408 分段缺失突变体酵母双杂交载体构建

3.4.3 作用位点的查找

3.4.3.1 ATF3 同FHL2 作用位点的确定

3.4.3.2 FHL2 同ATF3 作用位点的确定

3.4.3.3 ZNF408 同ZNF408 自作用位点的确定

3.4.4 根据β-半乳糖苷活性寻找各种突变体作用部位

3.4.4.1 ATF3 和FHL2 各突变体之间的相互作用

3.4.4.2 ZNF408 与FHL2 及其各突变体之间的相互作用

3.4.5 cDNA 文库筛选

3.4.5.1 cDNA 文库的来源及处理结果

3.4.5.2 cDNA 文库的扩增

3.4.5.3 中等规模质粒抽提

3.4.5.4 筛库结果

3.4.6 小结

3.4.7 讨论

3.5 展望

第四章结论

4.1 论文创新点

4.2 论文取得的研究成果

参考文献

附录

致谢

肝脏再生调控相关转录因子间相互作用网络的初步研究

论文摘要

论文目录

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