论文摘要
目的:筛选出三种苦参类生物碱不同比例混合后对肿瘤细胞生长抑制作用最大的混合比例,并研究其诱导肿瘤细胞凋亡的作用。材料与方法:分别用苦参碱（0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,9.6mg/ml）;氧化苦参碱（0.8,1.6,3.2,6.4,9.6,19.2mg/ml）;槐定碱（0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,9.6mg/ml）处理人乳腺癌MCF-7细胞株,未加药组为对照组,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定三种单碱不同浓度下细胞的生长抑制率,得出生长抑制率在40%～50%之间时各碱的浓度;根据正交实验设计所得到的9种混合比例不同的混合碱（总碱浓度相同）对A549等12株肿瘤细胞进行筛选;将最佳组合混合碱与苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱在同等剂量下比较它们对随机选取的A375、bel、NS-1、NCI、MCF-7五株肿瘤细胞的生长抑制作用;HE及Hoechst 33342/PI双染观察混合碱作用前后A549等12株肿瘤细胞的形态变化;流式细胞仪分析药物处理MCF-7细胞后细胞周期的变化。结果:①不同浓度苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱作用MCF-7后,MTT比色法测定出抑制率在40%～50%时,三种单碱的浓度在1.6～3.2mg/ml之间。②最佳组合混合碱对A549等12株肿瘤细胞中的10株都有更明显的生长抑制作用;③对于随机选取的5株细胞,在同等剂量下,优化出的混合比例比苦参碱,氧化苦参碱,槐定碱单独作用于癌细胞时生长抑制作用强;④普通光学显微镜下观察HE染色结果,实验组细胞失去原有的特定形状,细胞体急剧变小,连接消失,与周围的细胞脱离。细胞骨架解体。核固缩,染色体边集在核膜内侧显新月体形,核碎裂。胞质浓缩,细胞器密度增高,出现浓染颗粒。细胞膜出泡,芽生形成膜包裹的凋亡小体。而正常细胞经染色后仍保持细胞原有的生长形状（如梭形或多角形）,细胞核规整,染成均一蓝色。随着不同比例混合碱对肿瘤细胞生长抑制作用的增强镜下凋亡细胞的比例也明显增高。⑤Hoechst 33342/PI双染在荧光显微镜下观察细胞凋亡:对照组细胞用Hoechst 33342染色,胞核呈弥散均匀蓝色荧光;实验组凋亡细胞核呈亮蓝色,细胞核或细胞质内出现致密浓染颗粒块状荧光,有的核呈分叶,碎片状,边集。核与PI共染出现少量的红色荧光,晚期凋亡细胞红色荧光加强。⑥流式细胞仪结果显示,与对照组相比,以最佳混合比例混合的混合碱处理人乳腺癌细胞株MCF-7后, G0/G1,期细胞比例增多,S期细胞比例降低,说明细胞阻滞于G0/G1期,DNA合成能力受到抑制。讨论:细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程。目前临床上使用的手术治疗,化疗,放疗,生物疗法,基因治疗等方法都没能取得很好的效果。研究细胞凋亡将会为治疗肿瘤提供新思路和新方法。苦参碱类生物碱广泛存在于豆科植物苦参（Sophora Flavescens Ait.） ,苦豆子（S.Q lopecuroioles L）及广豆根（S.snbprostrata chun at T.chon）中。苦参类生物碱可防治脑水肿及肝炎,具有降温、镇痛作用,可加强心肌收缩力,抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗肝纤维化,利胆、止泻,保护胃肠粘膜,祛痰平喘。此外,还有抗病毒、抗寄生虫、抗炎、免疫调节及抗瘢痕形成等作用。本研究采用MTT比色法优选出对肿瘤细胞生长抑制作用最强的三种单碱的混合比例,并对A549等12株细胞进行了筛选,实验证明:苦参碱,氧化苦参碱,槐定碱对MCF-7均有明显的抑制作用,并且优化出的混合比例比其它各比例及三种单碱单独作用于癌细胞的效果要好。HE染色及Heochst33342/PI双染结果均显示出典型的细胞凋亡的形态学特征。经流式细胞仪分析显示:经混合碱（比例1:1:1）)1.2mg/ml处理MCF-7细胞24h后,可增加G0 /G1期细胞所占百分比,降低S期百分比,提示该混合碱对MCF-7细胞产生的抑制作用是阻止细胞进入S期,使细胞堆积于G0 /G1期. S期主要完成DNA的合成以及与DNA有关的组蛋白的合成,因此可以推测,该混合碱可以抑制DNA的合成。通过实验结果显示:优化出的混合比例对癌细胞的生长抑制作用强于其它混合比例及各单碱,且对多株肿瘤细胞均有明显的诱导凋亡作用,因此,通过该比例混合的混合碱将会发挥更强大的抗肿瘤作用。