食物抗原与类风湿性关节炎的相关性研究

论文摘要

目的：1.通过建立类风湿性关节炎大鼠CIA模型,寻找一种新的可以干扰或作用于RA的蛋白,初步探讨此蛋白与RA的相关性；2.分析这种蛋白在RA发病机制中的作用。方法：1.建立类风湿性关节炎的动物模型（CIA模型）：牛II型胶原蛋白（Bovine CollagenⅡ）和弗氏不完全佐剂（IFA）充分乳化后作为CIA模诱导剂,对Wistar大鼠尾根、足底、背部和脊椎两侧四点注射,一周后加强免疫一次,对CIA模型进行全面评价,如：关节肿胀度、组织病理学、免疫组化检测和细胞因子检测等；2.食物抗原与CIA的相关性：通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测和免疫印迹法（Western blot）初步检测食物中一些抗原和食物中各种异源型胶原蛋白与CIA的相关性；3.蛋白结构分析：通过Protein Explorer 2.80蛋白三维重建软件和Peptool Liter蛋白质二维重建软件对特异性蛋白结构的初步预测,分析特异性蛋白的结构相关性,解释说明实验结果；4.食物抗原干预CIA模型：为了研究临床食物抗原对类风湿性关节炎患者的影响,本实验用食物抗原对CIA模型进行干预,即对CIA模型鼠进行食物抗原灌胃实验,检测CIA模型大鼠的各方面变化,观察记录实验鼠的活动和饮食变化,观察肠道病理变化和代谢变化,并对实验结果进行分析总结。结果：1.动物模型在首次免疫后,实验组大鼠食欲开始下降,活动频繁度下降,加强免疫后一周,实验组大鼠四肢肿胀,佐剂对照组和空白对照组的大鼠无明显变化,实验组大鼠踝关节直径,血清TNF-α、IL-17、IL-6和IL-1水平明显高于佐剂对照组和空白对照组；实验组踝关节滑膜细胞免疫荧光抗原定位检测到很强的荧光,佐剂对照组和空白对照组荧光强度很弱；实验组RA的发病率为77.8%：2.血清ELISA检测食物中异源性胶原蛋白的免疫原性很高,八大类食物抗原中鸡蛋和牛奶与RA存在交叉免疫,并进行统计学分析,差距有统一学意义（P< 0.05）:Western-blot检测到鸡蛋和牛奶中存在实验组有别于佐剂对照组和空白对照组有两条蛋白条带（分别在45kd～60kd和80kd～90kd之间）,初步认为鸡蛋中的特异性蛋白是卵清蛋白,牛奶中的特异性蛋白为酪蛋白；3.牛Ⅱ型胶原蛋白、鸡蛋中卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白的二维和三维结构分析认为此三种蛋白在结构上存在相同的抗原位点和结构相似性,即鸡蛋中的卵清蛋白和牛奶中的一种蛋白（初步认为是酪蛋白）的抗原表位与牛Ⅱ型胶原蛋白存在部分结构相似性；4.对CIA模型大鼠灌胃实验发现,大鼠的炎症细胞因子的水平升高,肠道的通透性增大,胃肠道病理发生改变。结论：1.Ⅱ型胶原蛋白配合弗氏不完全佐剂可以很好的诱导建立CIA模型；2.初步认为食物抗原鸡蛋中（初步认为是卵清蛋白）和牛奶中的一种蛋白（初步认为是酪蛋白）与RA的发病存在一定的相关性,可能加重RA的病情,对于其与RA发病机制相关性还不是很清楚；3.由蛋白质的二维和三维结构分析中也初步分析认为,鸡蛋中的卵清蛋白和牛奶中的一种蛋白（初步认为是酪蛋白）可能产生的是假阳性反应；4.类风湿性关节炎大鼠在进食某种食物后病情加重与其肠道的通透性和肠道免疫可能存在一定的相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 类风湿性关节炎动物模型（CIA模型）的建立
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要设备和试剂
• 1.1.2 材料与主要溶液
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 生物信息学分析
• 1.2.2 实验Wistar大鼠分组
• 1.2.3 牛Ⅱ型胶原蛋白的提取
• 1.2.4 免疫诱导实验大鼠（建立CIA模型）
• 1.2.5 测量后足踝关节直径和足爪体积
• 1.2.6 CIA模型关节损伤评估
• 1.2.7 组织病理切片
• 1.2.8 免疫荧光定位（检测实验鼠关节滑膜Ⅱ型胶原蛋白）
• 1.2.9 类风湿性因子（RF）、细胞因子和抗CII抗体的检测
• 1.2.10 CIA模型循环免疫复合物C3d补体、特异性抗体IgG和IgA的检测
• 1.2.11 统计学处理
• 1.3 结果
• 1.3.1 生物信息学分析结果
• 1.3.2 牛Ⅱ型胶原蛋白的提取
• 1.3.3 实验模型关节直径、足爪体积肿胀度及关节损伤评价
• 1.3.4 实验各组模型鼠类风湿因子RF的检测
• 1.3.5 实验各组模型鼠肿瘤坏死因子和白介素17的检测
• 1.3.6 循环免疫复合物的检测
• 1.3.7 组织病理学检测
• 1.3.8 免疫荧光抗原定位（检测关节滑膜处的Ⅱ型胶原蛋）
• 1.3.9 抗Ⅱ型胶原蛋白的检测
• 1.3.10 特异性抗体的检测
• 第二部分 食物抗原与类风湿性关节炎的相关性检测
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要设备与试剂
• 2.1.2 材料与主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 检测食物中各种异源性胶原蛋白免疫原性
• 2.2.2 八大类食物抗原的提取
• 2.2.3 检测八大食物抗原的免疫原性
• 2.2.4 血清特异性IgE抗体的检测
• 2.2.5 特异性食物抗原的蛋白印记检测
• 2.2.6 特异性蛋白质的二维和三维结构的预测结构
• 2.3 结果
• 2.3.1 食物中各种异源性胶原蛋白免疫原性检测
• 2.3.2 各种异源型胶原蛋白印迹
• 2.3.3 八大类食物抗原的粗提蛋白
• 2.3.4 八大类食物抗原免疫原性的检测
• 2.3.5 食物抗原中特异性IgE抗体的检测
• 2.3.6 八大类食物抗原蛋白印记的检测
• 2.3.7 鸡蛋粗提抗原与RA的相关性（蛋白印迹检测）
• 2.3.8 鸡蛋特异性卵清蛋白（OVA）与RA的相关性（蛋白印迹）
• 2.3.9 食物抗原中牛奶粗提蛋白的Western blot反应
• 2.3.10 牛Ⅱ型胶原蛋白、卵清蛋白和酪蛋白三维结构预测
• 2.3.11 类风湿性关节炎易感氨基酸序列二维结构重建
• 第三部分 食物抗原干预CIA模型的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要设备与试剂
• 3.1.2 材料与主要溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 牛Ⅱ型胶原蛋白的提取及CIA模型的抗原干预（灌胃）
• 3.3.2 实验各组大鼠的观察记录和细胞因子的检测
• 3.2.3 肠道通透性的检测（双糖实验）
• 3.2.4 实验大鼠小肠的组织病理学观察
• 3.2.5 统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 细胞因子的检测与实验前CIA模型的比较
• 3.3.2 双糖实验
• 3.3.3 实验大鼠回肠的组织病理学观察
• 第四部分 讨论
• 第五部分 结论
• 致谢
• 参考文献
• 硕士研究生期间参加的科研项目情况
• 综述
• 参考文献