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XBP-1通过调控染色质大规模伸展增强ERα转录活性

2020-11-22阅读(755)

XBP-1通过调控染色质大规模伸展增强ERα转录活性

论文摘要

人 X 盒结合蛋白（XBP-1）是非折叠蛋白应答途径（unfolded protein response,UPR）信号途径的重要调节因子,具有转录激活活性,并有两种剪切形式:XBP-1S和 XBP-1U。XBP-1 广泛参与细胞分化、增殖、凋亡等多种信号途径,但对其如何发挥功能还知之甚少。 XBP-1 的转录调节作用提示其功能的发挥可能是通过调节染色质结构来实现的。本文中,利用大规模染色质结构检测技术,在哺乳动物细胞中观察到 XBP-1S 和XBP-1U 表达的蛋白募集,复制染色体上一段含有 lac 操纵子的区域,野生型 XBP-1S和 XBP-1U 以及它们的转录激活结构域都增强了染色质伸展活性,而没有转录激活结构域的突变体则完全消除了这种染色质伸展活性。XBP-1S 和 XBP-1U 具有染色质伸展活性的结构域与其转录激活结构域相吻合。由于蛋白质必须通过与其他蛋白相互作用来发挥功能,因此推断这一区域通过与其它蛋白质的相互作用来发挥 XBP-1 的转录调节功能。 实验室已用酵母双杂交实验结果表明,以乳腺癌相关基因 COBRA1 为诱饵,从乳腺文库中分离到 XBP-1 基因,初步显示两者之间存在相互作用关系。GST 沉降实验表明,COBRA1 与野生型 XBP-1S 和 XBP-1U 都能结合,且与 XBP-1S 的结合结构域定位于 COBRA1 的 135-335 个氨基酸;与 XBP-1U 的结合结构域定位于 COBRA1的 135-335 和 285-480 氨基酸两个结构域。在转染含 lac 操纵子应答元件的 lac 荧光素酶报告基因实验中,COBRA1 能增强野生型 XBP-1S 和 XBP-1U 的转录活性,但对于XBP-1S 和 XBP-1U 的 DNA 结合结构域缺失突变体却没有作用,对野生型 XBP-1 的转录活性的刺激倍数低于对其只包含 DNA 结合结构域的突变体的刺激倍数。免疫共沉淀实验结果表明,COBRA1 与 XBP-1U 的结合能力大于 COBRA1 与 XBP-1S 的结合能力。染色质伸展实验表明,野生型 XBP-1S 和 XBP-1U 促进染色质伸展的区域与COBRA1 蛋白表达区域有共定位现象,但缺失突变体均无此现象。这些结果提示COBRA1 有可能参与 XBP-1 调控的信号通路。 实验已经证明 XBP-1 能与雌激素受体 ERα相互作用,并且能以激素不依赖的形式提高 ERα的转录活性,但这种作用机制尚不清楚。根据已有文献报道,ERα能在无配体（雌激素）存在时诱导染色质大规模伸展,实验将 ERα基因与 lac 操纵子基因融合,与 XBP-1 基因共转染特殊哺乳动物细胞,结果发现野生型 XBP-1 在雌激素存在的培养基里促进 ERα诱导染色质伸展活性,但当 XBP-1 缺失了 DNA 结合结构域时,这种促进 ERα诱导染色质伸展活性的能力消失;基于 ERα可与雌激素受体应答元件 ERE（estrogen response element）结合的原理,利用 ERE-luc 荧光素酶报告基因,检测

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩写词
  • 文献综述
  • 第一章 引言
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 引物合成及序列测定
  • 2.1.2 菌株、细胞株
  • 2.1.3 质粒
  • 2.1.4 细胞培养及转染试剂
  • 2.1.5 常用分子生物学试剂盒
  • 2.1.6 分子生物学工具酶
  • 2.1.7 抗体
  • 2.1.8 常规无机盐试剂
  • 2.1.9 大型仪器
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 载体的构建
  • 2.2.2 哺乳动物细胞的转染
  • 2.2.3 Western blot 分析
  • 2.2.4 免疫共沉淀
  • 2.2.5 GST-ERα融合蛋白在大肠杆菌中的表达
  • 2.2.6 GST 沉淀（pull-down）分析
  • 2.2.7 荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定
  • 2.2.8 ERα和 XBP-1 转录活性的测定
  • 2.2.9 反转录PCR（RT-PCR）
  • 2.2.10 染色质伸展实验
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 XBP-1 能诱导大规模染色质结构伸展
  • 3.1.1 用于诱导大规模染色质伸展重组质粒的构建
  • 3.1.2 XBP-1 两种剪切形式重组质粒的鉴定
  • 3.1.3 重组质粒在哺乳动物细胞中的表达
  • 3.1.4 XBP-15 和XBP-1U 能够诱导染色质大规模伸展
  • 3.1.5 XBP-15 和XBP-1U 诱导大规模染色质伸展结构域定位
  • 3.1.6 利用lac 系统检测XBP-1 融合蛋白的转录活性
  • 3.2 COBRA1 与XBP-1 相互作用并增强XBP-1 转录活性
  • 3.2.1 XBP-1 与 COBRA1 相互作用验证
  • 3.2.2 COBRA1 对XBP-1 转录激活功能的影响
  • 3.2.3 COBRA1 与XBP-1 相互作用对染色质结构的影响
  • 3.3 XBP-1 通过调控染色质大规模伸展增 ERα的转录活性
  • 3.3.1 XBP-1 与ERα存在相互作用
  • 3.3.2 野生型XBP-1 在A03 细胞中增强ERα调控的染色质大规模伸展
  • 3.3.3 XBP-1在A03细胞中能提高ERα转录活性
  • 第四章 讨论
  • 4.1 XBP-1 能诱导大规模染色质结构伸展
  • 4.2 COBRA1 与XBP-1 相互作用并增强XBP-1 转录活性
  • 4.3 XBP-1 通过调控染色质大规模伸展增 ERα的转录活性
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介

    • 相关论文文献

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