白蛋白修饰的人甲状旁腺激素的制备、纯化及活性研究

论文摘要

甲状旁腺激素（PTH）是调节骨代谢的重要激素之一。小剂量间歇性给予PTH可以增加骨形成,使骨量上升。为了提高PTH的稳定性和体内的半衰期,我们利用先期构建的酵母工程菌Pichia pastoris KM71/PTH-HSA进行了人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白（PTH-HSA）制备和纯化方法的研究,并对其药效活性进行了评价。论文研究了该菌株的生长曲线,通过正交试验确定了诱导PH6.5,温度30℃,每24h添加甲醇,保持甲醇浓度在2.5%,诱导时间为4d,融合蛋白PTH-HSA的摇瓶发酵最优条件。在该条件下表达量最高达180mg/L。建立了两种融合蛋白PTH-HSA的分离纯化路线并进行了比较。路线一发酵液经超滤浓缩、阴离子交换层析、凝胶过滤纯化,目的蛋白回收率约为20%。路线二发酵液经超滤浓缩,染料亲和层析纯化,目的蛋白回收率为61%,所得融合蛋白PTH-HSA纯度达到95%。Western杂交显示纯化的融合蛋白PTH-HSA具有很好的HSA和PTH抗原性,分子量约75 kDa,与理论预测值相同。间隙加药于成骨细胞,通过MTT法和PNPP偶氮法观察比较PTH-HSA和PTH对成骨细胞增殖、分化的影响。通过检测骨基质细胞/成骨细胞,C57/Black小鼠骨髓基质细胞RANKL和OPG基因的表达,比较PTH-HSA与PTH（1-34）多肽的生物活性。通过UAMS32骨基质细胞/成骨细胞与C57/Black小鼠骨髓悬浮细胞共培养实验,进一步观察和比较PTH-HSA与PTH（1-34）多肽的生物活性。通过分析骨细胞中骨形成标志性分子IGF-1（Insulin-like growth factor I）基因表达,比较PTH-HSA与PTH（1-34）多肽在体内促进骨合成代谢的生物活性。结果显示:PTH-HSA与PTH和PTH（1-34）多肽具有相似的生物活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 骨质疏松症及其治疗现状
• 1.1.2 甲状旁腺激素的结构与功能
• 1.1.3 甲状旁腺激素对成骨细胞作用的研究进展
• 1.1.4 甲状旁腺激素的药物化情况
• 1.2 甲状旁腺激素临床应用中存在的问题和解决方法
• 1.2.1 存在问题
• 1.2.2 解决方法
• 1.3 立题背景及研究内容
• 第二章 融合蛋白PTH-HSA 的制备及纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 材料与试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 Pichia pastoris KM71/PTH-HSA 菌株的生长曲线测量
• 2.2.2 正交试验优化表达条件
• 2.2.3 PTH-HSA 融合蛋白发酵上清的制备
• 2.2.4 发酵上清的两种预处理方法的比较
• 2.2.5 纯化路线一
• 2.2.6 纯化路线二
• 2.2.7 纯化产物分析与鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 Pichia pastoris KM71/PTH-HSA菌株的生长曲线
• 2.3.2 正交实验优化表达条件结果
• 2.3.3 PTH-HSA 融合蛋白发酵上清的制备
• 2.3.4 发酵上清的两种预处理方法的比较
• 2.3.5 纯化路线一
• 2.3.6 纯化路线二
• 2.3.7 纯化产物鉴定结果
• 2.4 结论
• 2.5 讨论
• 第三章 融合蛋白PTH-HSA 的活性评价
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 主要仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 成骨细胞分离与培养
• 3.3.2 成骨细胞的鉴定
• 3.3.3 PTH-HSA 对成骨细胞增殖的影响（MTT 法）
• 3.3.4 PTH-HSA 对成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的影响（PNPP 偶氮法）
• 3.3.5 PTH-HSA 对骨基质细胞/成骨细胞、C57/Black 小鼠骨髓基质细胞 RANKL 和 OPG 基因表达的影响
• 3.3.6 UAMS32 骨基质细胞/成骨细胞与 C57/Black 小鼠骨髓悬浮细胞共培养实验观察PTH-HSA 的生物活性
• 3.3.7 PTH-HSA 对骨细胞中 IGF-1（Insulin-like growth factor I） 基因表达的影响
• 3.4 结果
• 3.4.1 成骨细胞鉴定
• 3.4.2 MTT 法和 PNPP 法测定成骨细胞活性结果
• 3.4.3 PTH-HSA 对骨基质细胞成骨细胞,C57/Black 小鼠骨髓基质细胞 RANKL 和 OPG 基因表达的影响实验结果
• 3.4.4 UAMS32 骨基质细胞/成骨细胞与 C57/Black 小鼠骨髓悬浮细胞共培养实验观察PTH-HSA 的生物活性实验结果
• 3.4.5 PTH-HSA 对骨细胞中 IGF-1（Insulin-like growth factor I） 基因表达的影响实验结果
• 3.5 结论
• 3.6 讨论
• 小结
• 存在问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间发表的文章