论文摘要
第一部分黄芩苷对中波紫外线辐射Ha Ca T细胞干预作用的蛋白组学研究研究背景和目的随着地球臭氧层被破坏,日光中的紫外线辐射,尤其是波长为290-320nm的中波紫外线（UVB）对人类的伤害越来越大。皮肤是受UVB辐射直接作用的靶器官。长期反复的UVB辐射可引起皮肤细胞,主要是表皮细胞损伤,导致一系列皮肤不良反应如红斑、水肿、水疱、皮肤色素沉着、异常增生、光老化、癌前病变如光化性角化病,最终将导致皮肤癌的发生。但UVB光损伤的具体分子机制尚未完全得到阐明。从天然植物和传统中草药中开发新型防光药物具有高效和毒副作用轻微等特点,一直是研究的热点之一。本研究小组的先期研究发现,传统中药黄芩的主要单体活性成分黄芩苷可以减少人皮肤细胞（包括角质形成细胞和成纤维细胞）因照射UVB而升高的凋亡率、CPDs产量和IL-6分泌量,可以减少光产物的产生,并加快CPDs的清除,其光保护效应也反映在可减少照光后p53蛋白表达。有研究表明,黄芩苷具有较强的抗癌活性。然而,从整体上研究黄芩苷对人皮肤细胞的影响,以及黄芩苷发挥光保护的确切机制尚未见有报道。目前生命科学研究领域已进入到后基因组时代。各种生命活动包括生长、发育、凋亡、炎症、应激、衰老、肿瘤形成、药物作用等,均与组织细胞中蛋白质的表达和相互作用相关。蛋白质组学迅速成为当前生命科学中最重要的研究方向之一,运用蛋白组学技术动态、整体、定量地观察各种病理生理活动的发生、发展过程已被广泛应用于临床研究领域。本部分研究应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术重点研究UVB辐射和黄芩苷对人表皮角质形成细胞Ha Ca T株差异表达蛋白的影响。以进一步阐明皮肤光损伤分子机制以及探索黄芩苷具有的生物学活性和防光效应机制。方法培养永生化人皮肤角质形成细胞株Ha Ca T细胞,使用30 m J/cm2UVB进行照射并同时加入黄芩苷进行干预。细胞分为对照组、黄芩苷组、UVB24h组、UVB48h组、UVB72h组和黄芩苷+UVB组,于照光后不同时段分别收集细胞,裂解液溶解细胞蛋白。利用双向电泳方法分离细胞蛋白质,并用Image Master图像分析软件比较各组细胞的蛋白质图谱,筛选出的差异蛋白质点应用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其胶内酶解后的肽质量指纹图谱,然后利用Mascot查询软件搜寻Swiss-prot数据库鉴定蛋白质。结果我们获得了重复性好的Ha Ca T细胞蛋白质组双向凝胶电泳图谱。分析比较蛋白质图谱发现:（1）30 m J/cm2UVB照射后24h,与对照组比较分析后得到76个差异表达蛋白点,其中19个点仅在UVB辐射前Ha Ca T株细胞中表达,另24个点仅在UVB辐射后Ha Ca T细胞中表达;22个点在UVB辐射后Ha Ca T细胞中高表达,11个点在UVB辐射后Ha Ca T细胞中低表达。选取全部差异蛋白点进行质谱分析,获得71个点的肽质量指纹图;同时我们对照光后48和72h的蛋白质图谱进行比较,并对部分差异表达蛋白进行质谱分析,分别得到5和11个点的肽质量指纹图。经鉴定为与细胞骨架、应激、代谢、增殖、凋亡、肿瘤发生等调控相关的蛋白,如抑制素、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、热休克蛋白beta-1等。（2）黄芩苷使Ha Ca T细胞蛋白质组发生改变,我们选取18个差异蛋白质点,进行质谱分析,获得15个点的肽质量指纹图,初步鉴定为热休克蛋白beta-1、肌动蛋白、二氢嘧啶酶调节蛋白2等。（3）在UVB辐射前后加入黄芩苷进行干预可明显抑制UVB辐射引起的Ha Ca T细胞蛋白质组变化,20个UVB下调蛋白点受黄芩苷作用明显上调,而26个UVB上调蛋白点受黄芩苷作用明显下调。结论我们的研究表明,双向凝胶电泳结合质谱鉴定是人皮肤光损伤和药物作用蛋白质组学研究的可靠平台和有力工具。UVB辐射可引起显著角质形成细胞蛋白质组学变化,导致大量蛋白差异表达,黄芩苷可明显抑制UVB引起的蛋白质组差异表达变化。这些结果将为从蛋白质水平全面理解UVB致表皮细胞损伤过程以及阐明黄芩苷的防光作用分子机制奠定基础。第二部分翻译控制肿瘤蛋白在人皮肤鳞状细胞癌组织中的表达及其下调后对鳞癌细胞增殖和凋亡的影响研究背景和目的人皮肤鳞状细胞癌（Human cutaneous squamous cell carcinoma,SCC）起源于表皮角质化细胞或其附属器。SCC为起源于角质形成细胞的恶性肿瘤,好发于暴露部位的皮肤或粘膜,具有恶性程度高、生长快、易转移的特点;长期的日光曝露1、皮肤老化2是其发病的重要诱因。日光中的紫外线（UV）是皮肤癌发生的主要原因,特别是波长290 nm320 nm的中波紫外线（UVB）最具致癌性或突变性。基于肿瘤分化程度可将SCC分成三级:Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级。翻译控制肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein,TCTP）是自埃利希腹水肿瘤细胞系中发现的一个172个氨基酸大小的抗凋亡蛋白。这个蛋白被证实与细胞增殖及凋亡相关并且能够促进不同组织细胞的生长。但其在SCC中的表达情况及在皮肤SCC形成中的作用尚未见报道。在第一部分我们的研究中证实TCTP在致癌性最强的紫外线UVB辐射后表达量上调,在光保护剂黄芩苷作用后表达量下调,又TCTP已经被证实在多种肿瘤组织中存在着高表达,我们推测TCTP在鳞癌组织发生发展的过程中也起着促进的作用,并且可能是一个潜在的治疗靶点。本部分的研究在于检测翻译控制肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein,TCTP）在人皮肤鳞状细胞癌（Human cutaneous squamous cell carcinoma,SCC）组织及其细胞株A431及SCL-1中的表达,继而在A431细胞株中干扰TCTP的表达,观察其对鳞癌细胞凋亡及增殖的影响。方法免疫组化法观察TCTP蛋白在鳞癌组织中的表达情况;Western-Blot法检测TCTP蛋白在SCC细胞株A431及SCL-1中的表达情况;继而构建针对编码TCTP的基因TPT1（tumor protein translationally-controlled 1）的si RNA序列,通过脂质体转染法转入A431细胞中;RT-PCR法检测TPT1的表达,Western-Blot法检测TCTP蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法检测A431细胞增殖情况。结果（1）免疫组化结果显示在SCC中存在着TCTP的高表达,且其表达水平与癌组织的分级有着正相关关系（P<0.05）。（2）Western-Blot结果证实与人角质形成细胞株（Hacat）相比在A431细胞及SCL-1细胞株中都存在着TCTP的高表达,以A431细胞表达为甚。（3）RT-PCR及Western-Blot结果显示合成的si RNA可以有效下调A431细胞中PT1及TCTP的表达。（4）凋亡检测及MTT检测显示这种下调可引起A431细胞凋亡率的上升和细胞增殖的抑制。结论TCTP蛋白在SCC的发生发展过程中起着促进作用,可能成为一个新的肿瘤分子治疗靶点。
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