植物内生菌Bacillus amyloliquefaciens ES-2的分离筛选及其抗菌物质的研究

论文摘要

植物内生菌存在于各种植物中，在它们中广泛分布着抗菌活性菌株，是抗菌物质的重要潜在来源。有些内生菌能够分泌与宿主相同或相似的抗菌物质。其次，植物内生菌还是一个未开发的新领域，它们所产生的抗菌物质往往是新颖的，可能具有很好的应用特性。此外，由于植物本身自然地为那些对高等生物具有毒性的生物活性分子减少毒性充当了选择系统，从而使植物内生菌来源的抗生素细胞毒性减低。因此，利用植物内生菌筛选高效、新颖、低毒的抗菌活性物质潜力巨大。本研究的目的在于从植物内生菌中筛选出能产生抗菌活性高、抗菌谱广、安全的抗菌物质的菌株，并利用质谱对抗菌物质进行鉴定，同时对抗菌物质的理化性质、产抗菌物质的培养基及其产抗菌脂肽的发酵动力学进行了研究。研究结果分述如下：1．从16种植物材料中分离到有抗菌活性的内生菌23株；经复筛后，11株菌对黑曲霉有明显的抑制作用；分离的菌株中大部分对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，其中也有2-3株菌除对革兰氏阳性菌以及黑曲霉具有较强的抑菌活性之外，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌也有明显的抑制作用。大部分菌株产生的抗菌物质具有一定耐热性，所试菌株对胰蛋白酶和胃蛋白酶的作用均有抗性或部分抗性。从中药植物黄芩来源的内生菌ES-2菌株的抑菌谱最广，不仅能明显抑制革兰氏阳性菌而且对革兰氏阴性菌及部分霉菌和酵母也有显著的抑菌作用；所产生的抗菌物质能部分耐受121℃20min的热处理，对蛋白酶也较稳定。综合以上特性，确定ES-2菌株为下一步实验菌株。2．对植物内生菌ES-2菌株进行了分子生物学鉴定。通过总DNA提取，PCR扩增，得到1423bp的16SrRNA基因序列。PCR产物序列通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比较。通过Bioedit7.0和Treedrawing软件绘制系统发育树。结果显示，ES-2的16SrRNA基因序列和数据库中的淀粉液化芽孢杆菌（AY620954）的序列的同源性为99.72％。在细菌系统发育分类学上，ES-2菌株归属淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。3．ES-2菌株的发酵液经甲醇提取，提取物经Sephadex LH-20色谱柱分离后，再经LC-MS测定，证明分别含有fengycins、surfactins和iturins三组抗菌活性物质。经ESI-MS／MS-CID技术分析，鉴定出第一组物质为6个脂肪酸碳链长度为C14～C18的fengycin A同系物；5个脂肪酸碳链长度为C15～C19的fengycin B同系物；3个质荷比为1481.9、1495.9和1509.7的抗菌脂肽是脂肪酸碳链长度为C16～C18的新型线性脂肽。第二组抗菌活性物质为3个脂肪酸碳链长度为C11、C13和C14的[Leu7]型surfactin；以及1个脂肪酸碳链长度为C13的[Val7]型surfactin和1个C-13与C-14的一种[Leu7+Val7]混合型的surfactin。与相关文献报道相比较，推测出第三组抗菌活性物质可能为脂肪酸碳链长度为C18的iturin A或C17的bacillomycin F，以及1个可能是脂肪酸碳链长度为C12的iturins的成员bacillomycin L。4．描述了ES-2菌株产生的抗菌脂肽的紫外光谱、高效液相色谱图，以及LC-MS离子流图等特征图谱。分析结果可知，ES-2菌株产生的抗菌脂肽是由fengycin、surfactin和iturins几种脂肽的混合物组成，其中fengycin是主要成分。ES-2菌株产生的抗菌脂肽甲醇提取物在水中溶解性良好；溶于90％以下的甲醇和70％以下乙醇；而在正丁醇、异戊醇、三氯甲烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯中不溶解或微溶。抗菌提取物在pH2以下的水溶液中发生沉淀，在pH2-12条件下抗菌脂肽的抗菌活性稳定。抗菌提取物对热处理具有非常好的稳定性。紫外线对抗菌提取物的抗菌活性没有影响；胃蛋白酶对抗菌提取物的抗菌活性没有影响；胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶可以使该物质少量降解。ES-2菌株发酵提取物具有较广范围的抑菌谱，它对革兰氏阳性菌、阴性菌都有较强的抑制作用，尤其对霉菌显示了出色的抑制作用。5．培养基筛选发现，Landy培养基能产生较高产量的抗菌肽。通过进一步实验，对Landy培养基中的碳、氮源进行了筛选，确定了一种改良的Landy合成培养基为ES-2菌株产抗菌脂肽培养基。6．通过HPLC技术对Landy培养基中的碳氮源对ES-2菌株抗菌脂肽组分的影响进行了实验，发现葡萄糖是ES-2菌株产生fengycin和surfactin的良好碳源，特别是对surfactin的产生有明显的促进作用；蔗糖和乳糖也是产生fengycin的良好碳源；采用不同的糖为碳源对两种脂肽的组成有一定的影响。L-谷氨酸和L-天门冬酰胺是抗菌脂肽产生的良好氮源，它们对抗菌脂肽产生有促进作用；而不同的氨基酸组合并不有利于抗菌脂肽的产生。实验结果还显示，6种脂肪酸对抗菌脂肽的产生起到抑制作用。7．对ES-2菌株抗菌脂肽的深层发酵条件进行了优化。首先采用Plackett-Burman设计法，对影响抗菌肽发酵的显著因素进行筛选。结果表明，在所选取的12个相关因素中，对抗菌肽的产量具有显著影响的因子是KCL、FeSO4、温度。在Plackett-Burman试验设计结果基础上，采用Box-Behnken响应曲面法对影响抗菌肽发酵的3个关键影响因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究与探讨，并建立了预测模型方程。通过模型方程3-D图及其等高线图研究发现，在27.22℃、FeSO4 0.05mg／L，KCL0.78g／L的条件下，可获得抗菌肽含量的最大预期值。优化后的培养条件下抗菌肽含量从起始的1010.24mg／L提高到2130.12mg／L，是原来的2.1倍。8．研究了ES-2菌株分批发酵抗菌脂肽动力学过程和模型。结果发现菌体生长呈现典型的S型曲线；抗菌脂肽的生成和菌体生长是偶联型的。用Origin软件对动力学方程进行拟合，利用Logistic方程描述了菌体生长和产物合成的动力学过程；采用Luedeking-Piret方程阐述了底物消耗的动力学过程规律。实验结果可知，建立的三个模型都能较好地解释实验数据。

论文目录

• 目录
• 表格索引
• 图形索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写符号
• 第一章 文献综述
• 1 植物内生菌抗菌活性物质研究进展
• 1.1 植物内生菌作为抗菌活性物质重要来源的基本机制
• 1.2 植物内生菌抗菌活性物质的研究进展
• 1.3 产抗菌活性物质内生菌的筛选策略
• 1.4 结语
• 2 抗菌脂肽研究进展
• 2.1 抗菌脂肽的产生菌株
• 2.2 抗菌脂肽的结构及特性
• 2.3 抗菌脂肽的发酵生产
• 2.4 抗菌脂肽的合成机理及代谢调控
• 2.5 抗菌脂肽的应用
• 2.6 展望
• 3 本研究的目的意义及内容
• 参考文献
• 第二章 广谱抗菌活性植物内生菌ES-2菌株的分离筛选和分子生物学鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 分离植物材料名称和来源
• 1.2 试剂
• 1.3 供试菌株
• 1.4 仪器
• 1.5 抗菌活性内生菌的分离筛选方法
• 1.6 目标菌株的鉴定方法
• 2 结果与分析
• 2.1 内生菌的分离和筛选
• 2.2 ES-2菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 2.3 ES-2菌株的分子生物学鉴定
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 B.amyloliquefaciens ES-2菌株抗菌物质的分离、纯化及结构的鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 培养方法
• 1.4 仪器
• 1.5 试剂
• 1.6 抗菌物质的纯化
• 1.7 抗菌物质的HPLC/ESI/CID分析
• 2 结果和讨论
• 2.1 Sephadex LH-20分离
• 2.2 HPLC分离
• 2.3 ES-2菌株产生的抗菌物质LC-MS分析
• 2.4 脂肽fengycin组分的结构分析
• 2.5 脂肽Surfactin结构分析
• 2.6 第三抗菌组分的分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 ES-2菌株抗菌脂肽生物学和理化特性的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 抗菌物质的制备和提取
• 1.4 抗菌活性的测定
• 1.5 特征紫外吸收光谱的测定
• 1.6 高效液相色谱（HPLC）的测定
• 1.7 抗菌物质的组成及分子量
• 1.8 溶解性试验
• 1.9 酸碱对抗菌活性的影响
• 1.10 热处理对抗菌活性的影响
• 1.11 紫外线对抗菌活性的影响
• 1.12 蛋白酶水解对抗菌活性的影响
• 1.13 抑菌谱的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 特征紫外吸收光谱
• 2.2 高效液相色谱（HPLC）图
• 2.3 抗菌物质的组成及分子量
• 2.4 溶解性
• 2.5 酸碱对抗菌脂肽的影响
• 2.6 热处理对抗菌活性的影响
• 2.7 紫外线对抗菌活性的影响
• 2.8 蛋白酶水解对抗菌活性的影响
• 2.9 ES-2菌株发酵提取物的抑菌谱
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第五章 培养基对ES-2菌株产抗菌脂肽的影响分析
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 培养方法
• 1.5 抗菌物质浓度的测定
• 1.6 产抗菌脂肽培养基的筛选
• 1.7 几种培养基组分对抗菌脂肽及其同系物的组成的影响
• 2 结果和分析
• 2.1 产抗菌脂肽培养基的筛选
• 2.2 几种培养基组分对抗菌脂肽及其同系物的组成的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 ES-2菌株抗菌脂肽发酵条件的优化
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 培养方法
• 1.4 抗菌物质浓度的测定
• 1.5 抗菌脂肽发酵条件关键影响因子的筛选—Plackett-Burman设计
• 1.6 响应面法优化抗菌肽发酵条件—Box-Behnken设计
• 2 结果与分析
• 2.1 抗菌物质发酵培养条件关键影响因子的确定
• 2.2 响应面法优化抗菌肽发酵条件
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第七章 ES-2菌株产抗菌肽发酵动力学研究
• 1 材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 仪器设备
• 1.4 培养方法
• 1.5 生物量的测定
• 1.6 还原糖的测定
• 1.7 抗菌脂肽浓度的测定
• 1.8 数据统计分析方法
• 2 结果和分析
• 2.1 ES-2菌株抗菌脂肽分批发酵过程
• 2.2 菌体生长动力学模型
• 2.3 抗菌脂肽生成动力学模型
• 2.4 底物消耗动力学模型
• 3 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 创新摘要
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文